曹勛紅 王志東 韓 偉 陳育紅 唐菲菲 孫于謙 王景枝 許蘭平 張曉輝 王 昱 劉開(kāi)彥 黃曉軍 趙翔宇（北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)血液研究所，國(guó)家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100044）

異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是治療惡性血液病有效甚至唯一的手段，但移植后復(fù)發(fā)仍是移植后主要并發(fā)癥，影響移植療效。目前移植后復(fù)發(fā)常規(guī)治療方式包括化療、聯(lián)合供者淋巴細(xì)胞回輸（donor lymphocyte infusion，DLI）等，但DLI雖能明顯緩解移植后復(fù)發(fā)，卻增加了回輸后移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

NK細(xì)胞是機(jī)體重要的天然免疫細(xì)胞，在免疫監(jiān)視和腫瘤清除過(guò)程中起重要作用。RUGGERI等［1］證實(shí)殺傷免疫球蛋白（KIR）配體不相合的異基因NK細(xì)胞在急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）患者中可發(fā)揮促進(jìn)植入、抗急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD）和抗腫瘤作用。MILLER等［2］研究報(bào)道，異基因NK細(xì)胞治療在難治復(fù)發(fā)AML患者體內(nèi)有較好的安全性和一定療效。但受限于人體NK細(xì)胞數(shù)較少，NK細(xì)胞臨床應(yīng)用受到限制。MASUYAMA等［3］建立了CD3聯(lián)合CD52單抗體外誘導(dǎo)供者來(lái)源NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，臨床前研究證實(shí)其具有抗腫瘤作用。本研究采用CD3聯(lián)合CD52單抗體外誘導(dǎo)移植供者來(lái)源NK細(xì)胞擴(kuò)增，并將其回輸給DLI無(wú)效的移植后復(fù)發(fā)急性白血病患者，初步研究NK細(xì)胞回輸至移植后復(fù)發(fā)患者體內(nèi)的免疫學(xué)變化及臨床療效。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 入組病例及標(biāo)準(zhǔn) 入組患者8例，入組條件為2011年2月至2014年1月于北京大學(xué)血液病研究所進(jìn)行allo-HSCT且移植后復(fù)發(fā)患者，患者主要臨床特點(diǎn)見(jiàn)表1。

1.1.2 預(yù)處理方案 全部采用常規(guī)改良BU/CY（白消安/環(huán)磷酰胺）方案，HLA配型不合移植預(yù)處理中加用抗胸腺細(xì)胞球蛋白（ATG）［4］。

1.1.3 干細(xì)胞動(dòng)員和采集 全部患者采用骨髓聯(lián)合外周血干細(xì)胞移植，所有患者均以G-CSF動(dòng)員5～6 d（-3 d開(kāi)始），劑量為5μg/kg［5-6］。

1.1.4 aGVHD預(yù)防 采用環(huán)孢素（CsA）聯(lián)合霉酚酸酯（MMF）及短程甲氨蝶呤（MTX）方案［7］。

1.1.5 植活標(biāo)準(zhǔn) 連續(xù)3 d中性粒細(xì)胞絕對(duì)值（ANC）≥0.5×109L-1為粒細(xì)胞植活，連續(xù)7 d PLT≥20×109L-1為血小板植活［8］。

1.1.6 主要試劑 6色抗體組合：CD3-Percpcy5.5、CD62L-FITC（美國(guó)Becton Dickinson公司）；CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue（美國(guó)Biolegend公司）；CCR7-PECY7、NKG2C-PE（美國(guó)RD$systems公司）；8色抗體組合：CD3-Amcyan、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC、NKG2A-PE、NKG2D-Percpcy5.5、NKp30-APC，NKp46-PECY7（美國(guó)BD Bioscience公司）；CD107a-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）及莫能霉素、Cytofix/Cytoperm試劑盒（美國(guó)Becton Dickinson公司）。

1.2 方法

1.2.1 NK細(xì)胞富集、擴(kuò)增 采集健康供者來(lái)源外周血40 ml，提取單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)抗CD3（0.1μg/ml）和抗CD52單克隆抗體（20μg/ml）于T-225瓶中共同刺激4 d，轉(zhuǎn)至新開(kāi)發(fā)的含自體血漿和IL-2的NKGM-1培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，每3 d更換1次含IL-2的新鮮培養(yǎng)基［3］。流式分選擴(kuò)增后的CD3-CD56+平均活率為94.475%，擴(kuò)增后NK細(xì)胞平均占比為44.35%，8例患者NK細(xì)胞及T細(xì)胞擴(kuò)增占比及回輸給患者的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表2。

表2 入組患者NK細(xì)胞擴(kuò)增活率、比例及回輸數(shù)量Tab.2 Expansion rates，ratio and number of NK cellsinfused into enrolled patients

1.2.2 標(biāo)本留取 ①留取供者培養(yǎng)前及擴(kuò)增后的NK細(xì)胞，流式監(jiān)測(cè)NK細(xì)胞擴(kuò)增前后數(shù)目、比例、凋亡及表型變化；②留取回輸后5周內(nèi)外周血，1次/周，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CD3-CD56+NK細(xì)胞亞群動(dòng)力學(xué)變化，同時(shí)檢測(cè)NK細(xì)胞IFN-γ分泌水平及殺傷活性。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.2.3.1 NK細(xì)胞表型檢測(cè) ①取全血100～200μl，加入6色抗體組合：CD3-Percpcy5.5、CD62L-FITC、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、CCR7-PECY7、NKG2C-PE，避光孵育30 min，溶血，PBS洗滌后上機(jī)檢測(cè)；②取全血100～200μl，加入8色抗體組合：CD3-Amcyan、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC、NKG2A-PE、NKG2D-Percpcy5.5、NKp30-APC，NKp46-PECY7，避光孵育30 min，溶血，PBS洗滌后上機(jī)檢測(cè)；③NK細(xì)胞擴(kuò)增前后表型抗體組合見(jiàn)文獻(xiàn)［9］。

1.2.3.2 NK細(xì)胞抗白血病功能檢測(cè) 采用淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cells of peripheral blood，PBMC）計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，設(shè)實(shí)驗(yàn)孔及對(duì)照孔各2個(gè)，200μl/孔接種于96孔板，給予IL-2 1 000 U/ml孵育過(guò)夜，實(shí)驗(yàn)孔加入K562細(xì)胞（與PBMC比例為5∶1），對(duì)照孔加入等體積RPMI1640培養(yǎng)基，同時(shí)每孔加入CD107a-PE及莫能霉素0.14μl孵育4 h后終止孵育，采用5色熒光標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記膜表面標(biāo)記及細(xì)胞內(nèi)抗原表達(dá)。所用細(xì)胞膜表面免疫熒光包括CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC，按照Cytofix/Cytoperm試劑盒說(shuō)明固定破膜后標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)免疫因子IFN-γ。

1.2.4 患者移植后微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）監(jiān)測(cè) 伴有重現(xiàn)性染色體異常的急性白血病患者，以其特征性標(biāo)志基因（如ETO）作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，＞0.4%為陽(yáng)性［9］；無(wú)特征性標(biāo)志基因的急性白血病患者，采用WT1基因作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，＞0.6%為陽(yáng)性［10］。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白血病相關(guān)免疫表型（leukemia-associated aberrant immune phenotypes，LAIPs）。于移植后1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4.5個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月監(jiān)測(cè)MRD，出現(xiàn)1次基因或LAIPs陽(yáng)性的患者需在2周后復(fù)查。間隔2周連續(xù)2次出現(xiàn)基因/LAIPs陽(yáng)性或同時(shí)出現(xiàn)基因和LAIPs陽(yáng)性為MRD陽(yáng)性，即分子生物學(xué)復(fù)發(fā)；骨髓中原始細(xì)胞＞5%為血液學(xué)復(fù)發(fā)。入組標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)患者（血液學(xué)復(fù)發(fā)和/或分子生物學(xué)復(fù)發(fā)）可給予DLI，DLI后療效不滿意患者給予NK細(xì)胞回輸治療。給予DLI和NK細(xì)胞回輸治療后繼續(xù)監(jiān)測(cè)MRD。所有患者知情同意。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0及R軟件分析數(shù)據(jù)，采用非配對(duì)T檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者臨床特點(diǎn) 本研究中4例接受了同胞HLA全相合allo-HSCT，4例接受了同胞HLA單倍型相合allo-HSCT，男5例，女3例。7例移植時(shí)處于完全緩解狀態(tài)；1例移植前為復(fù)發(fā)狀態(tài)?；颊呓邮艿?次供者來(lái)源NK細(xì)胞回輸?shù)闹形粫r(shí)間為移植后745.5 d。2020年5月隨訪終止時(shí)，共有5例患者死亡：患者1的直接死因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染，患者2死于移植后血栓性微血管?。╰hrombotic microangiopathy，TMA），患者7為重癥肺炎導(dǎo)致的呼吸衰竭，患者6和8為血液學(xué)復(fù)發(fā)。

2.2 預(yù)后 4例治療有反應(yīng)。病例3：難治復(fù)發(fā)AML患者，同胞全合移植后18月余再次出現(xiàn)骨髓MRD陽(yáng)性，伴髓外復(fù)發(fā)（皮膚），右大腿后側(cè)結(jié)節(jié)持續(xù)20余天，因放化療不耐受，接受NK細(xì)胞回輸治療，共計(jì)回輸NK細(xì)胞5次，前2次NK細(xì)胞回輸前聯(lián)合HAA化療，每次間隔時(shí)長(zhǎng)為3～5個(gè)月，回輸后序貫IL-2一百萬(wàn)單位注射2周，第1次NK細(xì)胞，回輸后結(jié)節(jié)消退，MRD轉(zhuǎn)陰，無(wú)其他不良反應(yīng)，至今患者無(wú)白血病長(zhǎng)期生存；病例4：?jiǎn)伪缎鸵浦埠?個(gè)月AML患者骨穿MLL-MLL基因持續(xù)陽(yáng)性，NK細(xì)胞回輸治療共計(jì)1次，回輸前無(wú)化療，回輸后MLL-MLL基因轉(zhuǎn)為陰性，無(wú)其他不良反應(yīng)，至今患者無(wú)白血病長(zhǎng)期生存；病例5：?jiǎn)伪缎鸵浦埠?6月骨髓增生異常綜合征（MDS）患者，MRD由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，為異常髓系幼稚細(xì)胞，經(jīng)過(guò)化療（AA方案）聯(lián)合供者淋巴細(xì)胞回輸治療后2個(gè)月復(fù)查骨髓仍FCM陽(yáng)性，因此接受NK細(xì)胞治療，共計(jì)回輸3次，每次間隔2個(gè)月，第1次回輸后骨髓FCM即轉(zhuǎn)陰，無(wú)其他不良反應(yīng)，至今患者無(wú)白血病長(zhǎng)期生存；病例7：同胞全合移植后13月余B-ALL患者，骨穿WT1由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，F(xiàn)CM結(jié)果提示有異常髓系幼稚細(xì)胞，經(jīng)過(guò)化療聯(lián)合供者淋巴細(xì)胞回輸2個(gè)月復(fù)查骨穿WT1仍為1.1%，接受NK細(xì)胞治療，共計(jì)回輸5次，前3次回輸前聯(lián)合COPD方案化療，每次間隔2個(gè)月左右，第2次回輸后WT1為0.23%，但第3次回輸后骨髓FCM表型異常且WT1為0.88%，因WT1和免疫殘留持續(xù)陽(yáng)性，DLI后隨之行第4、5次NK細(xì)胞回輸，第5次回輸后WT1為0.17%，骨髓FCM轉(zhuǎn)陰，回輸過(guò)程中無(wú)其他不良反應(yīng)，但在allo-HSCT后1年死于重癥肺炎導(dǎo)致的呼吸衰竭；4例治療無(wú)反應(yīng)：病例1、2、6、8，其中1例為持續(xù)MRD陽(yáng)性，3例為血液學(xué)復(fù)發(fā)，經(jīng)過(guò)NK細(xì)胞聯(lián)合化療或DLI治療后分子學(xué)及血液學(xué)復(fù)發(fā)指標(biāo)均未得到緩解?；颊?：難治復(fù)發(fā)AML患者，同胞全合移植后30個(gè)月，腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）-FCM陽(yáng)性，骨髓FCM表型異常，第1次FLAG化療序貫NK細(xì)胞回輸治療后CSF-FCM轉(zhuǎn)陰，骨髓FCM轉(zhuǎn)陰，回輸后2個(gè)月骨髓FCM復(fù)陽(yáng)，行HAA方案化療聯(lián)合2次NK細(xì)胞回輸，此后骨髓及腦脊液FCM仍復(fù)陽(yáng)，回輸期間無(wú)不良反應(yīng)，最終因中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染死亡；患者2：?jiǎn)伪缎鸵浦埠?4個(gè)月B-ALL患者，回輸前骨髓原始細(xì)胞占7%，增生V級(jí)，DLI治療后2個(gè)月共計(jì)回輸NK細(xì)胞2次，回輸后因持續(xù)粒缺未評(píng)估，最終因重度GVHD及TMA死亡；患者6：MRD持續(xù)陽(yáng)性AML患者，單倍型移植后15月余AML1-ETO為98.7%，接受NK細(xì)胞回輸治療，回輸前無(wú)化療，共計(jì)回輸1次，回輸后降至3.5%，無(wú)其他不良反應(yīng)，最終死于血液學(xué)復(fù)發(fā)；患者8：難治復(fù)發(fā)AML患者，同胞全合移植后4月余ETO為56%，外周原始細(xì)胞占50%，DLI后行NK細(xì)胞回輸治療，共計(jì)回輸1次，回輸前未接受化療，回輸后再次給予化療，無(wú)其他不良反應(yīng)，肝臟GVHD未加重，但最終死于血液學(xué)復(fù)發(fā)。

2.3 體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的生物學(xué)特性 采用CD3聯(lián)合CD52單抗方法體外擴(kuò)增健康供者外周血來(lái)源NK細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供者來(lái)源NK細(xì)胞擴(kuò)增后表型以早期不成熟亞群為主，主要表現(xiàn)為NKG2A+NK細(xì)胞培養(yǎng)后明顯增加，而CD57+亞群明顯下降，CD3-CD56dimCD57+KIR+擴(kuò)增前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。NK細(xì)胞功能發(fā)揮取決于活化型及抑制性受體平衡，采用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增前后NK細(xì)胞活化型受體及抑制性受體變化（圖1B、C），擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面NKG2D、DNAM-1及NKP30平均熒光強(qiáng)度明顯上調(diào)，同時(shí)，抑制性受體CTLA-4、PD-1、Tim-3及Tigit平均熒光強(qiáng)度表達(dá)擴(kuò)增后也明顯增強(qiáng)。由于CD69及CD25在NK細(xì)胞高表達(dá)可分別指示NK細(xì)胞殺傷能力及增殖水平提升，本研究對(duì)此進(jìn)行評(píng)估并發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面CD25及CD69平均熒光強(qiáng)度明顯高于擴(kuò)增前，提示擴(kuò)增后NK細(xì)胞被活化（圖1E、F）。NK細(xì)胞組織異質(zhì)性高且在不同組織臟器中發(fā)揮重要作用，其體內(nèi)循環(huán)與表面趨化型因子表達(dá)密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面CXCR3、CX3CR1及4-1BB平均熒光強(qiáng)度較擴(kuò)增前明顯增強(qiáng)，說(shuō)明擴(kuò)增的NK細(xì)胞組織趨化能力提升（圖1D）。

圖1 NK細(xì)胞擴(kuò)增前后表型變化Fig.1 Phenotype changes before and after expansion of NK cells

2.4 NK細(xì)胞體內(nèi)回輸后淋巴細(xì)胞數(shù)量動(dòng)力學(xué)變化 所有接受NK細(xì)胞回輸后的病例白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞總數(shù)恢復(fù)動(dòng)態(tài)規(guī)律如圖2A、B所示，其在有反應(yīng)患者與無(wú)反應(yīng)患者中恢復(fù)規(guī)律無(wú)明顯差異。而有反應(yīng)組患者（病例3、4、5、7）T細(xì)胞比例（占淋巴細(xì)胞百分比）在與無(wú)反應(yīng)患者相比無(wú)明顯規(guī)律，但回輸后第2周除病例8外，無(wú)反應(yīng)組T細(xì)胞比例均低于有反應(yīng)組（圖2C），尤其是回輸后前3周無(wú)反應(yīng)組T細(xì)胞比例低于有反應(yīng)組（圖2D），說(shuō)明回輸后T細(xì)胞也可能參與抗腫瘤作用。

圖2 NK細(xì)胞回輸后體內(nèi)各細(xì)胞數(shù)量動(dòng)力學(xué)變化Fig.2 Dynamic changes of other cell number in vivo after NK cell infusion

2.5 NK細(xì)胞回輸后體內(nèi)亞群動(dòng)力學(xué)變化 有反應(yīng)組（病例3、4、7）CD56brightNK細(xì)胞亞群整體恢復(fù)水平明顯高于無(wú)反應(yīng)組（病例1、2、6），而無(wú)反應(yīng)組患者8的CD56brightNK細(xì)胞亞群恢復(fù)效果中整體水平高于有反應(yīng)組病例5（圖3A），各病例CD56dimNK細(xì)胞亞群恢復(fù)趨勢(shì)與CD56brightNK細(xì)胞相反（圖3B）。NK細(xì)胞表面NKG2A表達(dá)與NK細(xì)胞治療后反應(yīng)無(wú)明顯相關(guān)性，治療無(wú)反應(yīng)組病例6及病例1NKG2A亞群分布在NK細(xì)胞回輸治療后始終處于較低水平，雖然病例1治療1周后NKG2A表達(dá)約達(dá)60%，但治療后第2周迅速下降，而后在3、4周維持在30%左右，其他病例則在回輸治療后5周內(nèi)維持相對(duì)較高水平，變化趨勢(shì)也較為平穩(wěn)（圖3C）。CD57+NK細(xì)胞亞群的病例恢復(fù)趨勢(shì)與KIR+NK細(xì)胞一致，即有反應(yīng)組（病例4、5、7）亞群水平明顯高于無(wú)反應(yīng)組，提示NK回輸治療后對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷可能依賴(lài)于成熟NK細(xì)胞亞群功能發(fā)揮；進(jìn)一步亞群成熟度分析也提示無(wú)反應(yīng)組（病例1、2、8）CD56dimNKG2A-CD57-KIR-比例明顯高于有反應(yīng)組（病例3、4、5、7），兩組間其他亞群趨勢(shì)變化無(wú)規(guī)律（圖4A、B）。

圖3 NK細(xì)胞回輸后體內(nèi)亞群動(dòng)力學(xué)變化Fig.3 Dynamic changes of NK subsets in vivo post NK cells refusion

圖4 回輸后無(wú)反應(yīng)和有反應(yīng)患者不同時(shí)間點(diǎn)不同成熟度NK細(xì)胞亞群（CD56bright、CD56dimNKG2A+、CD56dimNKG2AKIR-CD57+、CD56dimNKG2A-KIR-CD57-、CD56dimNKG2AKIR+CD57-、CD56dimNKG2A-KIR+CD57+）動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Different maturity levels of NK subsets（CD56bright，CD56dimNKG2A+，CD56dimNKG2A-KIR-CD57+，CD56dim NKG2A-KIR-CD57-，CD56dim NKG2A-KIR+CD57-，CD56dimNKG2A-KIR+CD57+）at different time points between patients with response to NK infusion and those without response

2.6 NK細(xì)胞回輸后的活化型受體及功能動(dòng)力學(xué)變化 NK細(xì)胞回輸后治療反應(yīng)良好病例3、4、5、7的NKG2D、NKp30及NKp46占NK細(xì)胞比例均明顯高于無(wú)反應(yīng)治療患者，均在60%以上，且隨著移植時(shí)間推移，治療反應(yīng)良好病例上述水平呈上升趨勢(shì)。而NKG2C占NK細(xì)胞的比例在治療反應(yīng)良好組與無(wú)反應(yīng)治療組未顯示差異性趨勢(shì)。NK細(xì)胞治療有反應(yīng)病例（病例3、4、5、7）CD107a在NK細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)明顯高于治療無(wú)反應(yīng)患者。而NK細(xì)胞IFN-γ分泌水平在NK細(xì)胞治療后趨勢(shì)并不明顯，NK細(xì)胞分泌IFN-γ的水平除病例4在第3周達(dá)到峰值，且明顯高于其他患者分泌水平，但其在第4周又驟降至基線水平，基本恢復(fù)至其他7例在NK細(xì)胞治療過(guò)程中的基準(zhǔn)（圖5）。

圖5 NK細(xì)胞回輸后活化型受體NKG2D、NKp30、NKp46、NKG2C動(dòng)力學(xué)變化及細(xì)胞脫顆粒、IFN-γ因子分泌能力變化Fig.5 Dynamic changes of activated receptors NKG2D，NKp30，NKp46，NKG2C and degranulation and secretion of IFN-γafter NK adoptivetransfer

2.7 安全性評(píng)價(jià) 病例2接受NK細(xì)胞治療前有活動(dòng)性GVHD和TMA，NK細(xì)胞治療后GVHD和TMA無(wú)明顯變化，病例3、6的GVHD癥狀在NK細(xì)胞回輸治療后明顯緩解，其中1例回輸前全身皮膚菲薄，雙上肢散在紅色皮疹，口腔內(nèi)多發(fā)潰瘍，回輸后cGVHD活動(dòng)性癥狀緩解；另一例移植后慢性GVHD肝臟表現(xiàn)，回輸后癥狀緩解，提示NK細(xì)胞治療可能發(fā)揮抗GVHD功能，需進(jìn)一步研究。

3 討論

NK細(xì)胞是機(jī)體重要的天然免疫細(xì)胞，無(wú)需預(yù)先致敏便可識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞，在免疫監(jiān)視和腫瘤清除過(guò)程中起重要作用。HLA半相合健康供者由于缺少部分NK細(xì)胞免疫球蛋白受體，部分減弱了抑制性受體對(duì)NK細(xì)胞功能的影響，可更好發(fā)揮腫瘤殺傷能力，因此增強(qiáng)NK細(xì)胞功能或過(guò)繼性回輸NK細(xì)胞療法已逐漸成為造血干細(xì)胞移植中抗白血病治療的重要觀念［11］。目前研究認(rèn)為，體內(nèi)NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞效靶比越高，清除腫瘤能力越強(qiáng)。健康人群獲取的NK細(xì)胞數(shù)有限，越來(lái)越多體外擴(kuò)增技術(shù)興起彌補(bǔ)了NK細(xì)胞數(shù)不足的問(wèn)題。MASUYAMA等［3］通過(guò)CD3聯(lián)合CD52單抗體外刺激人外周血單核細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞擴(kuò)增效率高，抗腫瘤功能增強(qiáng)，該體系的建立摒棄了耗時(shí)的去T細(xì)胞步驟及體外飼養(yǎng)層細(xì)胞準(zhǔn)備，但該技術(shù)擴(kuò)增的NK細(xì)胞在保證安全性前提下是否對(duì)人類(lèi)具有一定治療效果尚無(wú)報(bào)道?；诖?，課題組對(duì)移植后復(fù)發(fā)或持續(xù)MRD陽(yáng)性患者過(guò)繼性回輸體外供者來(lái)源NK細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)了回輸后5周內(nèi)NK細(xì)胞亞群及功能動(dòng)力學(xué)變化，初步探討以CD3聯(lián)合CD52單擴(kuò)增的NK細(xì)胞在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化及臨床療效。

本研究提示，以CD3聯(lián)合CD52單抗對(duì)NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增效率高，殺傷功能強(qiáng)，從目前8例結(jié)果來(lái)看，有3例MRD陽(yáng)性患者于NK細(xì)胞回輸治療后轉(zhuǎn)陰，1例髓外（皮膚）緩解，但對(duì)血液學(xué)復(fù)發(fā)無(wú)效，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病復(fù)發(fā)有待進(jìn)一步研究。提示NK細(xì)胞主要優(yōu)勢(shì)是清除體內(nèi)微小殘留病，而對(duì)血液學(xué)復(fù)發(fā)患者療效不佳。ZHAO等［12］在小鼠NCG血液瘤模型中過(guò)繼性回輸經(jīng)mbIL-21/4-1BBL擴(kuò)增的NK細(xì)胞證實(shí)，大劑量和連續(xù)多次回輸NK細(xì)胞有利于腫瘤清除，臨床研究也證實(shí)，對(duì)鞏固治療期間持續(xù)微小殘留病陽(yáng)性患者接受氟達(dá)拉濱聯(lián)合環(huán)磷酰胺預(yù)處理或常規(guī)鞏固治療聯(lián)合單倍型供者來(lái)源NK細(xì)胞回輸可誘導(dǎo)50%～60%微小殘留病轉(zhuǎn)陰，且無(wú)明顯不良反應(yīng)。雖然MILLER等［2］研究表明過(guò)繼性NK細(xì)胞回輸治療難治復(fù)發(fā)患者取得了一定療效，但誘導(dǎo)難治復(fù)發(fā)白血病患者緩解率也僅有20%～30%，提示NK細(xì)胞抗白血病治療仍有較大提升空間，通過(guò)改造NK細(xì)胞提高其體內(nèi)存活時(shí)間，或通過(guò)多次、高劑量NK細(xì)胞回輸有望提高NK細(xì)胞抗腫瘤能力。

NK細(xì)胞活化功能可分為兩方面：一是基于NK細(xì)胞成熟度而定，隨著NK細(xì)胞發(fā)育分化成熟，細(xì)胞殺傷能力逐漸增強(qiáng)；二是取決于其表面活化型受體與抑制型受體平衡。本研究中，NK細(xì)胞成熟指標(biāo)CD57及KIR表達(dá)在有反應(yīng)組均明顯高于無(wú)反應(yīng)組，提示腫瘤個(gè)體異質(zhì)性對(duì)NK細(xì)胞影響不一，也從側(cè)面反映腫瘤負(fù)荷減低可能與回輸后NK細(xì)胞成熟度有關(guān)［13］。同時(shí)，NK細(xì)胞表面活化型受體NKp30、NKp46及NKG2D表達(dá)在有反應(yīng)組均明顯高于無(wú)反應(yīng)組，說(shuō)明NK殺傷能力指標(biāo)CD107a分泌水平也在有反應(yīng)組趨勢(shì)較高，進(jìn)一步說(shuō)明回輸后活化型受體占比更多的NK細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞患者中預(yù)后更好［14-15］。提示腫瘤清除可能與NK細(xì)胞功能恢復(fù)相關(guān)，與KHAZNADAR等［16］報(bào)道一致，即NK細(xì)胞采用免疫調(diào)節(jié)劑恢復(fù)部分功能后，與AML細(xì)胞系接觸增多，殺傷作用增強(qiáng)。

移植后復(fù)發(fā)患者采用過(guò)繼性NK細(xì)胞回輸治療，無(wú)不良反應(yīng)，且2例患者慢性GVHD癥狀緩解，提示安全性良好，但由于樣本量較少，且CD3聯(lián)合CD52體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的策略與目前其他飼養(yǎng)層細(xì)胞的擴(kuò)NK細(xì)胞策略是否有明顯優(yōu)越性尚不可知。YANG等［17］通過(guò)RNA-seq技術(shù)探究?jī)煞N不同擴(kuò)增體系的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本差異，發(fā)現(xiàn)221-mIL-21飼養(yǎng)層細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞相較K562-mIL-21擴(kuò)增的NK細(xì)胞分化程度更低，記憶性更高，說(shuō)明不同擴(kuò)增體系除影響NK細(xì)胞擴(kuò)增效率，也影響擴(kuò)增NK細(xì)胞自身生物學(xué)功能。提示后續(xù)評(píng)估NK細(xì)胞治療效率時(shí)，應(yīng)考慮不同擴(kuò)增體系對(duì)NK細(xì)胞的影響。本研究擴(kuò)增體系提示NK細(xì)胞明顯活化且組織趨化能力上調(diào)，NK細(xì)胞表面抑制性受體PD-1、Tim-3、CTLA4及Tigit熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯上調(diào)。PD-1、Tim-3、CTLA-4及Tigit是阻斷T細(xì)胞及NK細(xì)胞免疫功能的重要耗竭性受體［18-20］。但也有研究認(rèn)為T(mén)im-3及Tigit在NK細(xì)胞的表達(dá)是NK細(xì)胞功能活化及成熟的重要指標(biāo)，因此，需綜合評(píng)估擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面耗竭性受體表達(dá)上調(diào)對(duì)NK細(xì)胞功能的影響［21-22］。另外，本研究未充分評(píng)估對(duì)NK細(xì)胞回輸后其他免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC及巨噬細(xì)胞等表型及功能，已有研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞、DC及巨噬細(xì)胞能直接或間接影響NK細(xì)胞發(fā)育成熟、細(xì)胞毒因子分泌功能［23-24］。NK細(xì)胞回輸后其他免疫細(xì)胞是否參與增強(qiáng)有反應(yīng)組NK細(xì)胞功能值得進(jìn)一步研究。

總之，本研究對(duì)CD3聯(lián)合CD52單抗體外擴(kuò)增NK細(xì)胞后，過(guò)繼性回輸治療移植復(fù)發(fā)患者后的免疫學(xué)變化進(jìn)行了初步探討，臨床應(yīng)用的安全性和有效性尚需擴(kuò)大樣本量及重新設(shè)計(jì)臨床研究進(jìn)一步探討。