叢 碩 李正超 朱紫馨 劉詠梅 胡亞欣 程義局 程明亮 （貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽(yáng) 550003）

隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們的生活環(huán)境、飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的改變，隨之引發(fā)的慢性代謝性疾病的發(fā)病率逐年增加，其中肥胖、代謝性脂肪性肝?。╩etabolic-dysfunction-associated fatty liver disease，MAFLD）和糖尿病等疾病躍居前列［1］。MAFLD是指發(fā)病機(jī)制排除酒精和其他誘發(fā)繼發(fā)性肝脂肪變性因素外，以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征［2］，臨床以肝組織病理學(xué)活檢、影像學(xué)及血液生物標(biāo)志物為證據(jù)，同時(shí)結(jié)合以下三項(xiàng)體征之一：超重/肥胖、Ⅱ型糖尿病、代謝功能障礙作為診斷MAFLD新標(biāo)準(zhǔn)［3］。MAFLD是多種因素共同參與的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制除了遺傳因素外，還與飲食、胰島素抵抗、脂質(zhì)過(guò)氧化、膽汁酸代謝和腸道菌群等因素密切相關(guān)。目前多采用保肝、改變飲食結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)等方法來(lái)達(dá)到緩解或改善疾病的目的。

凱里酸湯作為貴州省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，其由西紅柿、辣椒、大米和生姜等多種天然農(nóng)作物經(jīng)傳統(tǒng)工藝兩次自然發(fā)酵而成，富含番茄紅素、辣椒堿、維生素C/E、鈣、磷等多種有效成分［4］。番茄紅素能抑制肝臟脂肪變性、修復(fù)肝損傷及改善肝功能［5］。辣椒堿同樣可減輕肝臟脂肪變性，防止肝損傷［6］。本課題組前期對(duì)貴州省凱里市開展的MAFLD流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)厝巳褐?，MAFLD的發(fā)病率為18.19%，而食用凱里酸湯人群中，MAFLD的發(fā)病率為12.60%，明顯低于全國(guó)平均水平29%［7］，且長(zhǎng)期食用酸湯的人群發(fā)病率也低于該地區(qū)平均水平。因此，本研究擬利用高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠模型為研究對(duì)象，通過(guò)調(diào)節(jié)飲食-腸道菌群-膽汁酸代謝來(lái)探討凱里酸湯對(duì)MAFLD的改善作用及其可能機(jī)制，為凱里酸湯防治MAFLD提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 34只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，周齡6周，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 凱里酸湯由貴州亮歡寨餐飲娛樂(lè)管理有限公司提供；蛋白提取試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；BCA定量試劑盒購(gòu)自碧云天公司；免疫組化和DAB顯色試劑盒購(gòu)自Bioss公司；HE和油紅O試劑盒購(gòu)自南京雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司；一抗：抗β-actin抗體購(gòu)自Bioss公司；抗IL-6抗體、抗TNF-α抗體均購(gòu)自Abcam公司；抗TLR-4抗體購(gòu)自Proteintech公司；抗NF-κBp65抗體購(gòu)自CST公司；二抗：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體、羊抗鼠抗體均購(gòu)自普美生物公司。

1.1.3 主要儀器 雙垂直電泳儀購(gòu)自北京六一公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)買Bio-Rad公司；高速離心機(jī)購(gòu)自BECKMANAllegra X-30R Centrifuge公司；旋渦振蕩器購(gòu)自杭州米歐公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自耐博公司；Cobas 702全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自羅氏Cobas公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、MAFLD模型構(gòu)建及酸湯干預(yù)所有SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組（ND，n=8）、正常飲食+酸湯組（NS，n=8）、模型對(duì)照組（HF，n=10）和高脂飲食+酸湯組（HS，n=8）。ND組和NS組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，HF組和HS組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)以誘導(dǎo)MAFLD模型。飼料喂養(yǎng)時(shí)NS組和HS組大鼠給予酸湯灌胃干預(yù)，ND組和HF組大鼠給予等體積雙蒸水灌胃。飼喂12周后，隨機(jī)從HF組中取2只大鼠處死，收取血和肝組織樣本，通過(guò)生化和病理組織學(xué)檢查確認(rèn)造模是否成功。

1.2.2 標(biāo)本收集 各組大鼠自由飲水?dāng)z食12周后，水合氯醛麻醉后心臟取血，稱量各組大鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)；收集血和肝組織用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 生化指標(biāo)活性/含量檢測(cè) 將全血置于低速離心機(jī)4 000 r/min離心5 min，取上清，檢測(cè)各組大鼠生化指標(biāo)活性及含量。

1.2.4 HE和油紅O染色觀察肝組織病理學(xué)改變及脂肪變性程度 采用4%多聚甲醛固定肝組織，脫水浸蠟，石蠟包埋，制成3μm厚的石蠟切片，脫蠟透明后行HE和油紅O染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及脂肪小滴多少與大小。

1.2.5 免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測(cè)肝組織中TNF-α的變化 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)，3%H2O2滅活組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min，正常山羊血清工作液封閉30 min，孵育一抗4℃過(guò)夜，室溫復(fù)溫30 min，室溫孵育二抗30 min，DAB顯色，顯微鏡觀察，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，自來(lái)水返藍(lán)，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察TNF-α的變化情況。

1.2.6 糞便16SrRNA測(cè)序檢測(cè)大鼠腸道菌群變化 實(shí)驗(yàn)干預(yù)12周后，大鼠處死前，固定大鼠，無(wú)菌去酶EP管直接接取大鼠自然排出的糞便，采用Misep技術(shù)對(duì)大鼠糞便進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA測(cè)序，在OTU水平上，對(duì)各組大鼠腸道菌群的多樣性及豐度進(jìn)行α分析。各組大鼠腸道菌群多樣性及豐度用Observed species指數(shù)表示。

1.2.7 Western blot檢測(cè)肝組織中IL-6、TNF-α、TLR-4和NF-κBp65等蛋白表達(dá) 稱取0.020 g肝組織加入蛋白裂解液充分研磨裂解，4℃離心20 min取上清，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，配制蛋白樣本。配制SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入一抗：IL-6、TNF-α、TLR-4和NF-κB p65，4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜，孵育相應(yīng)二抗，TBST洗膜，ECL顯影曝光，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image J 1.6軟件分析各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白與β-actin的比值用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）或百分比（%）表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凱里酸湯對(duì)各組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)的影響 與ND組相比，HF組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)及Lee's指數(shù)均明顯升高（P＜0.05），提示模型構(gòu)建成功；與HF組相比，HS組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。各組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)變化（±s，n=6）Tab.1 Changes in body weight，liver weight，liver index and Lee's index of rats（±s，n=6）

表1 大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)變化（±s，n=6）Tab.1 Changes in body weight，liver weight，liver index and Lee's index of rats（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs NDgroup；2）P＜0.05 vs HFgroup.

Parameters Initial body weight/g Final body weight/g Liver weight/g Liver index/%Lee's index ND 235.83±10.67 428.33±27.81 11.19±1.01 2.59±0.18 2.94±0.04 NS 236.83±7.17 413.83±12.73 10.40±0.69 2.46±0.19 2.96±0.05 HF 237.17±6.59 503.83±36.441）14.33±1.741）2.85±0.161）3.06±0.061）HS 233.33±5.13 453.00±24.452）12.39±0.872）2.60±0.152）2.96±0.062）

2.2 凱里酸湯對(duì)各組大鼠血清中AST和ALT活性及TG、TC、HDL-C、LDL-C和TBA含量的影響 與ND組比較，HF組大鼠血清中AST和ALT活性及TG、TC、LDL-C和TBA含量顯著升高（P＜0.05），而血清中HDL-C含量顯著降低（P＜0.05）；與HF組比較，HS組大鼠血清中AST和ALT活性及TG、TC、LDL-C和TBA含量均顯著降低（P＜0.05），而血清中HDL-C含量均顯著升高（P＜0.05）。各組大鼠血清中AST和ALT活性及TG、TC、HDL-C、LDL-C和TBA含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清中ALT和AST活性及TC、TG、LDL-C、HDL-C和TBA含量測(cè)定結(jié)果（±s，n=6）Tab.2 Serum ALT，AST activity，TC，TG，LDL-C，HDL-C and TBA concentrations of rats in each group（±s，n=6）

表2 各組大鼠血清中ALT和AST活性及TC、TG、LDL-C、HDL-C和TBA含量測(cè)定結(jié)果（±s，n=6）Tab.2 Serum ALT，AST activity，TC，TG，LDL-C，HDL-C and TBA concentrations of rats in each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs NDgroup；2）P＜0.05 vs HFgroup.

Parameters ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）TC/（mmol·L-1）TG/mmol·L-1 HDL-C/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）TBA/（μmol·L-1）ND 55.17±10.87 160.28±13.78 1.56±0.41 0.44±0.17 0.44±0.06 0.14±0.05 7.53±1.12 NS 61.43±14.31 185.02±24.28 1.96±0.24 0.35±0.10 0.42±0.05 0.15±0.07 12.86±2.89 HF 125.65±35.361）391.57±161.581）2.26±0.191）1.34±0.171）0.35±0.031）0.29±0.021）29.28±8.221）HS 77.37±22.462）202.33±78.672）1.70±0.152）1.10±0.132）0.39±0.022）0.22±0.052）20.30±3.662）

2.3 凱里酸湯對(duì)各組大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 ND組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，周圍細(xì)胞索呈放射狀排列，無(wú)脂肪變性細(xì)胞；HF組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，肝小葉界限不清晰，出現(xiàn)大量球形脂滴；與HF比較，HS組大鼠肝組織病理形態(tài)得到明顯改善，球形脂滴減少或變小。各組大鼠肝組織病理改變結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理學(xué)改變Fig.1 Pathological changes of liver in each group rats

2.4 凱里酸湯對(duì)各組大鼠腸道菌群的影響 HF組菌群多樣性明顯降低，與ND組和HS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而NS組和HS組的菌群雖低于ND組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HS組與HF組菌群結(jié)構(gòu)上相近，但與ND組距離較遠(yuǎn)，NS組與ND組距離較近。且HF組與ND組和NS組、HS組的菌群結(jié)構(gòu)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。各組大鼠糞便腸道菌群α多樣性、PC分析和β多樣性分析結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠糞便腸道菌群分析Fig.2 Analysis of intestinal microflora in faeces of rats in each group

2.5 凱里酸湯對(duì)各鼠肝組織中IL-6和TNF-α含量的影響 與ND組比較，HF組大鼠肝組織中IL-6及TNF-α含量均顯著升高（P＜0.01）；與HF組比較，HS組大鼠肝組織中IL-6及TNF-α含量均顯著降低（P＜0.01）。各組小鼠肝組織中IL-6及TNF-α含量測(cè)定結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 各組大鼠肝組織中IL-6和TNF-α相對(duì)表達(dá)Fig.3 Content determination results of IL-6 and TNF-α in liver tissue of mice in each group

圖4 各組大鼠肝組織中TNF-α表達(dá)Fig.4 Expression of TNF-αin liver tissue of rats in each group

2.6 凱里酸湯對(duì)各鼠肝組織中TLR-4和NF-κB p65含量的影響 與ND組比較，HF組大鼠肝組織中TLR-4和p-NF-κB p65含量均顯著升高（P＜0.05）；與HF組比較，HS組大鼠肝組織中TLR-4和p-NF-κB p65含量均顯著降低（P＜0.05）。各組大鼠肝組織中TLR-4和p-NF-κBp65含量測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 各組大鼠肝組織中TLR-4和p-NF-κB p65相對(duì)表達(dá)Fig.5 Content determination results of TLR-4和p-NFκB p65 in liver tissue of rats in each group

3 討論

肝臟作為脂肪代謝的主要靶器官，長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)增加肝臟對(duì)脂肪的攝取，當(dāng)脂肪攝取量大于排出量時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肝脂肪變性［8］。運(yùn)用高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠動(dòng)物模型，具備胰島素抵抗、肥胖等特征，較好地模擬了人類MAFLD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［9］。本研究運(yùn)用高脂飲食飼養(yǎng)SD大鼠12周，構(gòu)建MAFLD大鼠模型，研究結(jié)果顯示，與ND組相比，HF組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)及Lee's指數(shù)均明顯升高，肝組織出現(xiàn)病理性改變及大量的球形脂滴，提示建模成功，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致［10］。而HS組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)及Lee's指數(shù)均顯著下降，肝組織病理形態(tài)及脂肪變性得到改善，提示凱里酸湯具有改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝臟病變的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，凱里酸湯可顯著降低HF組大鼠血清中AST、ALT活性、TG、TC及LDL-C含量，升高HDL-C含量，進(jìn)一步證明了凱里酸湯能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織病變。

高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD機(jī)制復(fù)雜，有眾多因素參與，腸道菌群紊亂及腸道屏障功能障礙是其關(guān)鍵因素。研究表明，腸道菌群紊亂可引起膽汁酸代謝紊亂，腸壁通透性增加，致使活性氧系、細(xì)菌內(nèi)毒素和乙醇及其毒性代謝產(chǎn)物大量進(jìn)入肝臟，最終導(dǎo)致肝損害加劇［11］。膽汁酸是膽固醇的終末降解產(chǎn)物，在脂肪代謝中起重要作用，研究表明，膽汁酸可通過(guò)直接或間接激活法尼醇X受體和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用，與肥胖、糖尿病和MAFLD等代謝性疾病有著密切關(guān)系［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)凱里酸湯干預(yù)后，與ND組相比，HF組大鼠腸道菌群及菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著改變，糞便腸道菌群的豐度和多樣性均顯著降低，厚壁菌門（Firmicutes）比例明顯升高，擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌比例降低，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門可產(chǎn)生更多的脂多糖和脫氧膽酸，通過(guò)肝門靜脈進(jìn)入肝臟，導(dǎo)致肝臟炎癥［14-15］。擬桿菌參與不可消化多糖的發(fā)酵，以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，能夠直接激活G蛋白偶聯(lián)受體，抑制組蛋白去乙?；福⒆鳛槟芰康孜?，從而調(diào)節(jié)各種生理過(guò)程，有助于身體健康［15-17］。而放線菌負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗炎特性的短鏈脂肪酸［18］。腸道菌群的這些改變也正是影響MAFLD發(fā)生、發(fā)展的重要因素。而經(jīng)過(guò)酸湯干預(yù)后的HS組的菌群結(jié)構(gòu)得到了改善，厚壁菌門比例降低，擬桿菌門和放線菌比例升高。同時(shí)，與ND組相比，HF組大鼠血清中TBA含量明顯升高，而凱里酸湯可顯著降低HS組大鼠血清中TBA含量，其機(jī)制可能與凱里酸湯干預(yù)后腸道菌群的改變進(jìn)而影響膽汁酸代謝相關(guān)［19］。

MAFLD患者常伴有肥胖和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）兩大特點(diǎn)，而因肥胖導(dǎo)致的腸道菌群失衡和腸壁通透性增加是機(jī)體內(nèi)毒素血癥發(fā)生的重要因素，腸道內(nèi)毒素通過(guò)門靜脈進(jìn)入肝臟，促進(jìn)肝臟炎癥反應(yīng)［20］，而肝臟炎癥反應(yīng)使肝細(xì)胞分泌膽汁酸異常，進(jìn)一步加重腸道菌群失衡，提示腸道和肝臟通過(guò)“腸-肝軸”，相互作用，相互影響［21］。肝臟炎癥反應(yīng)參與MAFLD發(fā)生發(fā)展且貫穿MAFLD整個(gè)過(guò)程，其機(jī)制與“二次打擊學(xué)說(shuō)”關(guān)聯(lián)緊密［22］?！岸未驌魧W(xué)說(shuō)”中一次打擊核心是IR，二次打擊是在IR基礎(chǔ)上導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)，促使TNF-α及IL-6等炎癥細(xì)胞因子大量釋放，引發(fā)肝細(xì)胞脂肪變性、凋亡、壞死及炎癥，最終導(dǎo)致MAFLD的發(fā)生［23］。研究發(fā)現(xiàn)，五味子提取物對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織炎癥損傷和肝細(xì)胞變性有較好的改善作用，其機(jī)制與抑制TNF-α及IL-6等炎癥因子的表達(dá)有關(guān)［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，HF組大鼠肝組織中IL-6和TNF-α含量明顯升高，而HS組大鼠肝組織中IL-6和TNF-α含量顯著降低，提示凱里酸湯可有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子有關(guān)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

腸道菌群失衡可誘發(fā)IR，在肝脂肪變性過(guò)程及肝臟炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用，是誘發(fā)MAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一［25］。脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，該物質(zhì)可通過(guò)Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）等介導(dǎo)的信號(hào)通路激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)［如：TNF-α、IL-6和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）等］的基因表達(dá)上調(diào)，是誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)及激活炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵因子［26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)，HF組大鼠肝組織中TLR-4和NF-κB含量明顯升高，而HS組大鼠肝組織中TLR-4和NF-κB含量顯著降低，提示凱里酸湯可通過(guò)抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，進(jìn)而抑制肝組織炎癥反應(yīng)，改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織病變。

綜上所述，凱里酸湯能夠明顯改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織病變，其機(jī)制可能與凱里酸湯改善腸道微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而改善膽汁酸代謝有關(guān)。凱里酸湯作為一類多種物質(zhì)經(jīng)過(guò)發(fā)酵而形成的混合物，其中富含的番茄紅素、辣椒堿、維生素C/E、鈣、磷等多種有效成分已經(jīng)得到了驗(yàn)證，但是課題組本次的研究并未對(duì)其主要成分進(jìn)行提取和驗(yàn)證，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。