王文萱，李云鵬，徐鶴寧，趙 鑫，馬 柔，張麗娜，張瑩瑩

（黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

皂苷(saponin)也叫做皂角苷、堿皂體、皂素、皂甙或皂草苷[1]。皂苷廣泛存在于陸地高等植物中，是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一[2]，具有殺菌、化感、殺病毒、殺蟲等多種生物活性，在植物抵御病蟲害過程中發(fā)揮著重要作用[3]。水茄(Solanum torvumSwartz.)為雙子葉植物綱茄科茄屬亞灌木，為藥食同源類野生植物[4]，也是茄科植物保護地嫁接栽培中常用的抗病砧木[5]。水茄葉片提取物和代謝物中的多種甾體皂苷具有細胞毒性、抗炎、抗病毒、抗真菌、抗抑郁和抗糖尿病活性，可用于營養(yǎng)品和多種草藥天然配方的新成分[6]。水茄植株提取物能顯著抑制多種植物病原真菌的生長；水茄葉部提取物對植物病原菌的抑制活性最好[7]。水茄葉片提取物能夠抑制霉菌毒素的產(chǎn)生，可作為抗真菌劑的來源，抑制真菌對植物的侵害，防止果品采后真菌感染和霉菌毒素污染[8]。RAJESH等[9]從水茄葉片的提取物中分離出了抗真菌化合物，經(jīng)分析鑒定為一種甾體皂苷。綜上所述可見，水茄葉片皂苷在醫(yī)學、食品、農(nóng)用方面都有很高的研究和利用價值。

響應面法(response surface methodology，RSM)是常用的對工藝過程進行優(yōu)化的方法，它能夠直觀地顯示出所設(shè)響應值與不同因素的函數(shù)關(guān)系，通過公式、圖表的分析篩選出最佳優(yōu)化條件[10]。應用響應面法可以了解到多個變量之間相互影響的關(guān)系，能夠準確地評估不同變量及其間交互作用對響應值的影響[11]。目前，響應面法在優(yōu)化皂苷[12]、多糖[13]、黃酮[14]等天然活性物質(zhì)的提取工藝中有廣泛的應用。

關(guān)于水茄總皂苷的提取工藝研究，目前尚未見報道。本試驗以水茄葉片中總皂苷提取率為評價指標，通過單因素試驗考察乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度對提取率的影響；在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行響應面試驗設(shè)計，對水茄葉片中總皂苷的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化。以期提高水茄葉片總皂苷的提取率，為日后水茄葉片總皂苷的研究和利用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：采集水茄健康葉片，洗凈晾干。

試劑：薯蕷皂苷（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司），無水乙醇、甲醇、石油醚、正丁醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CHY-6001多功能粉碎機，金華市莫菲家用電器有限公司；CP224S電子天平，德國Sartorius公司；SB5200DT超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵，天津華鑫儀器廠；UV-1780紫外分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；DHG-9240A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料前處理 將晾干的水茄葉片粉碎過40目篩，備用。

1.3.2 水茄葉片中總皂苷提取方法 稱取葉片粉末，倒入具塞錐形瓶中，以乙醇作為提取溶劑，加蓋搖勻，在超聲波清洗器中進行輔助提取，抽濾得提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)呈膏狀，用蒸餾水溶解，在分液漏斗中，用石油醚萃取脫脂，再用飽和的正丁醇溶液萃取，將正丁醇相旋轉(zhuǎn)蒸干，加蒸餾水溶解。

1.3.3 標準曲線的制作 以薯蕷皂苷為標準品，參照文獻[15]，用香草醛-冰乙酸/高氯酸法[16]進行顯色，隨行試劑做空白參比。繪制橫坐標為薯蕷皂苷濃度，縱坐標為吸光度值的標準曲線，求出回歸方程。

1.3.4 總皂苷濃度和提取率 水茄葉片中總皂苷濃度和提取率的計算見公式(1)和(2)。

式中：C為總皂苷濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；N為測定吸光度時的稀釋倍數(shù)，M為水茄葉片質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗

（1）乙醇濃度

分別以體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇提取，料液比1:5，溫度50℃，超聲功率輔助提取30 min。

（2）料液比

分別以料液比 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25進行提取，乙醇濃度80%，溫度50℃，超聲功率輔助提取30 min。

（3）提取時間

乙醇濃度80%，料液比1:5，溫度50℃，分別超聲輔助提取30、60、90、120、150 min。

（4）提取溫度

乙醇濃度80%，料液比1:5，分別以40、50、60、70、80℃，超聲輔助提取30 min。

1.3.6 響應面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應用Design-Expert 10分析軟件[17]，選擇Box-Behnken設(shè)計，以水茄葉片總皂苷提取率為響應值，設(shè)計自變量為乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度的四因素三水平響應面優(yōu)化試驗。試驗因素水平見表1。

表1 響應面設(shè)計因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 薯蕷皂苷溶液的標準曲線

標準曲線繪制以薯蕷皂苷濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標。依據(jù)標準曲線，可得回歸方程(3)。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對水茄葉片中總皂苷提取率的影響 如圖1所示，當乙醇濃度在50%～80%時，隨乙醇濃度升高，水茄葉片總皂苷提取率也逐漸升高。當乙醇濃度升到80%，提取率達到最大值。乙醇濃度較低時，提取率也較低，這可能是因為在提取溶劑中水的占比較多，多糖等水溶性物質(zhì)溶出比皂苷類物質(zhì)多[18]。因此，選擇乙醇濃度80%作為試驗設(shè)計的中水平。

圖1 乙醇濃度對超聲提取水茄葉片中總皂苷的影響

2.2.2 液料比對水茄葉片中總皂苷提取率的影響 如圖2所示，當料液比在1:5～1:15(g/mL)時，隨著料液比的增加，水茄葉片總皂苷提取率也隨之逐漸升高。在料液比達到1:15(g/mL)時，提取率達到了最大值。當液料比在1:15～1:25(g/mL)時，隨著料液比的增大，提取率逐漸下降，這可能是因為隨著溶液體積的增大，體系中水也逐漸增多，會使部分多糖類物質(zhì)溶解[19]，阻礙皂苷成分的溶出，從而影響提取率。因此，選擇料液比1:15(g/mL)為試驗設(shè)計的中水平。

圖2 料液比對超聲提取水茄葉片中總皂苷的影響

2.2.3 提取時間對水茄葉片中總皂苷提取率的影響 如圖3所示，當時間在30～90 min時，提取時間逐漸變長，水茄葉片總皂苷提取率也隨之升高。在提取時間達到90 min時，提取率達到了峰值。當提取持續(xù)時間超過90 min后，水茄葉片總皂苷提取率隨時間變長反而下降，這可能是因為皂苷類物質(zhì)發(fā)生了氧化和降解等因素的影響[20]，所以提取率逐漸下降。因此，選擇提取時間90 min作為設(shè)計的中水平。

圖3 提取時間對超聲提取水茄葉片中總皂苷的影響

2.2.4 提取溫度對水茄葉片中總皂苷提取率的影響 如圖4所示，當溫度在40～60℃時，隨提取溫度的升高，水茄葉片總皂苷的提取率也在逐漸升高，這可能是因為在一定范圍內(nèi)，溫度越高傳質(zhì)過程越易進行，隨著溫度的升高分子擴散也隨之變劇烈，溫度加快了溶質(zhì)的擴散，有利于活性物質(zhì)溶出。然而在60～80℃區(qū)間內(nèi)，水茄葉片總皂苷提取率緩慢下降，可能是因為在高溫下部分不穩(wěn)定的皂苷類物質(zhì)被破壞[21]。因此，選擇60℃作為設(shè)計的中水平。

圖4 提取溫度對超聲提取水茄葉片中總皂苷的影響

2.3 響應面試驗結(jié)果與優(yōu)化分析

2.3.1 響應面試驗結(jié)果 通過Design Expert 10軟件，設(shè)計自變量為乙醇濃度、料液比、提取時間和溫度的四因素三水平試驗。試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

通過Design Expert 10軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到如下回歸方程(4)。

由表3可知，響應面模型P=0.0001＜0.001，表示該模型差異極顯著。失擬P=0.0977＞0.05，模型失擬項沒有顯著性差異，模型總決定系數(shù)R2=0.9851，調(diào)整決定系數(shù)R2(Adj)=0.9702，以上3項表明該模型擬合性良好。預測決定系數(shù)R2(Pred)=0.9200，表示模型預測性良好；CV值為2.41%，表明試驗操作嚴謹可信；信噪比(Adeq precision)為30.925＞4，表示試驗結(jié)果能夠被得到的回歸方程很好地解釋。綜上所述，認為超聲提取水茄葉片總皂苷可以用此回歸方程進行結(jié)果預測。

表3 方差分析結(jié)果

續(xù)表3

2.3.2 響應面分析 通過表中各因素P值可知，C（提取時間）、D（提取溫度）這2個因素對總皂苷提取率的影響極顯著，B（料液比）影響顯著，A（乙醇濃度）影響不顯著；AB、AC、AD、BC、BD、CD各因素間的交互作用對響應值的影響不顯著。二次項總體影響極顯著(P＜0.001)。由F值的大小可判斷，在選擇的水平范圍內(nèi)，各因素影響總皂苷提取率的順序為提取時間(C)＞提取溫度(D)＞料液比(B)＞乙醇濃度(A)。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)，利用軟件繪制響應曲面和等高線，可直觀的顯示出任意2種因素對皂苷提取率的影響，見圖5～10。

圖5 乙醇濃度和料液比對總皂苷提取率影響的等高線及響應曲面

圖7 乙醇濃度和提取溫度對總皂苷提取率影響的等高線及響應曲面

圖8 料液比和提取時間對總皂苷提取率影響的等高線及響應曲面

圖9 料液比和提取溫度對總皂苷提取率影響的等高線及響應曲面

圖10 提取時間和溫度對總皂苷提取率影響的等高線及響應曲面

由圖5～10可知，任意2個影響因素相互影響的響應斜面都有一個最高點，這表示在選定的水平范圍內(nèi)得到的結(jié)果有極值，說明各因素選擇考察的水平較為適當[22]。響應曲面的斜率越大，各因素水平發(fā)生變化時對水茄葉片總皂苷提取率的響應程度越強[23]，所以各因素影響提取率的程度與方差分析結(jié)果吻合。各個交互因素的等高線都為橢圓形，表明AB、AC、AD、BC、BD、CD均有交互作用，其中CD的等高線更加接近于圓形，所以表明，時間和溫度交互作用最弱，BD的交互作用最強但P＞0.05，影響并不顯著。

依據(jù)線性二次多項式回歸方程可得水茄葉片總皂苷最佳提取工藝條件為乙醇濃度80.30%，料液比1:15.06(g/mL)，提取時間 95.56 min，提取溫度62.29℃，此時，水茄葉片總皂苷的理論提取率為38.82%。

2.4 水茄葉片總皂苷超聲提取最優(yōu)工藝驗證

對最佳工藝進行3次重復平行驗證實驗[24]，3次實驗總皂苷平均提取率為38.60%(RSD=0.24%)，與模型預測結(jié)果相吻合。實驗結(jié)果可證明，響應面法優(yōu)化總皂苷提取工藝重復性良好，優(yōu)化的參數(shù)具有實用價值，方案穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論及討論

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應面法對水茄葉片中總皂苷的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，對總皂苷的提取率的影響，提取時間和溫度極顯著、料液比顯著、乙醇濃度不顯著；且各因素之間都有交互作用，其中料液比與溫度的交互作用最強。優(yōu)化后的最佳工藝條件為乙醇濃度80.30%，料液比1:15.06(g/mL)提取時間95.56 min，提取溫度62.29℃，在此條件下，水茄葉片總皂苷的理論提取率為38.82%。

對優(yōu)化工藝進行驗證，皂苷平均提取率為38.60%(RSD=0.24%)，與模型預測值有0.24%相對標準誤差，本試驗嚴格控制了除變量以外的其他條件，如超聲提取時使用的容器、飽和正丁醇萃取的時間等，出現(xiàn)的誤差可能是由于超聲波清洗機持續(xù)工作產(chǎn)生機械熱能[25]，一定程度上影響了提取過程。綜上所述，驗證結(jié)果與模型預測結(jié)果相吻合，優(yōu)化的皂苷提取工藝重復性良好，穩(wěn)定可行，在最優(yōu)提取條件下，水茄葉片總皂苷的提取率可達38.60%。本試驗僅對水茄葉片總皂苷進行了超聲波輔助提取法的優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上可以進行水茄總皂苷的純化工藝研究，以期為水茄總皂苷的利用提供技術(shù)支持；水茄葉片總皂苷生物活性是否受到提取操作的影響，也有待驗證。