李 舟，楊雅云，戴陸園，張斐斐，阿新祥，董 超，王 斌，湯翠鳳

（1云南大學資源植物研究院，昆明 650504；2云南省農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所，云南省農業(yè)生物技術重點實驗室，農業(yè)部西南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，農業(yè)部云南稻種資源科學觀測實驗站，昆明 650223）

0 引言

水稻是世界上最重要的糧食作物，由Xanthomonas oryzaepv.Oryzae，Xoo引起的水稻白葉枯病，嚴重制約稻谷產量[1]。水稻生產上廣泛使用化學藥劑防治該病害，但長期實踐表明發(fā)掘抗病新基因、培育抗病品種是解決這一問題的最經濟和有效的途徑。然而，近年鮮有研究對經國際鑒定報道的抗病新基因進行概述歸納與總結，抗病基因作用機制并不清晰，也并未有文章報道白葉枯病抗病相關因子的研究進展。因此本文基于Xoo侵染、抗病機制研究，對近年來水稻抗白葉枯病基因的定位克隆、功能類型以及抗病相關因子的研究進展做了簡要綜述，以期為現(xiàn)階段抗白葉枯病基因的發(fā)掘利用和抗病機制深入研究提供參考。

1 Xoo致病機制與水稻抗病機制概述

白葉枯病菌通常從水稻自然開口處進入葉片組織，在細胞間隙繁殖，并通過木質部容器傳播到其他部分[2-3]。白葉枯病原菌通常會利用II型或III型分泌系統(tǒng)在植物體內更好的生長繁殖。其中，II型分泌系統(tǒng)能分泌多種碳水化合物降解酶削弱細胞壁，使Xoo更容易獲取營養(yǎng)[4-5]；III型分泌系統(tǒng)分泌效應蛋白轉錄激活物樣TAL和非TAL效應蛋白劫持寄主代謝以促進其生長發(fā)育[6-7]。同時，Xoo還能產生群體感應信號分子檢測局部種群密度以調節(jié)自身基因表達模式并分泌胞外多糖，阻塞木質部增強致病性[8-9]。

而水稻植株受到Xoo侵入后，基礎免疫PTI與效應觸發(fā)免疫ETI防御機制被觸發(fā)[10-11]。PTI和ETI由受體激酶蛋白、重復序列蛋白以及其他抗病因子介導。PTI包括活性氧(ROS)的產生、細胞內鈣濃度的增加、細胞壁胼胝質沉積、抗菌化合物以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活等[12]；ETI是定性抗性[13]，大部分由主效抗病基因調控，對病原菌某個或少數(shù)生理小種免疫或高抗，主要在細胞內發(fā)揮作用，這些抗性蛋白能夠直接或間接識別病原體在宿主細胞內分泌的特定毒力效應子，反應出了快速且更強的抗病性，它們通常與感染部位的程序性細胞死亡有關，還涉及其他防御反應包括ROS的產生、細胞壁的增強、有毒代謝物或蛋白質的積累以及激素水平的改變[14]。在植物抗病這一過程中，抗病基因與抗病相關因子參與植物PTI與ETI反應，通過編碼抗性蛋白、改變植物通路信號、改變細胞形態(tài)與結構等多種方式，調控植物抗病反應，最終使植物抵御白葉枯病或減輕植物感病癥狀等。

2 水稻抗白葉枯病基因的定位與克隆

2.1 水稻抗白葉枯病基因的定位現(xiàn)狀

在水稻抵御白葉枯病過程中，抗白葉枯病基因普遍參與植物PTI或ETI反應，由于宿主植物遺傳多樣性與抗病基因緊密關聯(lián)，不同的水稻品種或群體會出現(xiàn)不同的感染癥狀[15]。迄今利用各種方法定位出的抗白葉枯病的主效基因經過國際確認和文獻報道的至少有48個（見表1），其中31個為顯性基因Xa，17個為隱性基因xa，且發(fā)現(xiàn)的大量抗白葉枯病基因在第4號和第11號染色體上成簇分布，而第9和第10染色體上則暫未有抗白葉枯病基因被定位。對抗白葉枯病基因進行定位，促進了基因的進一步克隆及在水稻抗病育種中的利用。

表1 水稻抗白葉枯病基因的定位、連鎖標記、蛋白類型（*代表已克隆基因）

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 水稻抗白葉枯病基因的克隆

目前已被克隆的水稻抗白葉枯病主效基因有18個，其中Xa1、Xa3/Xa26、xa5、Xa21等基因的克隆研究情況已被何翔等[67]、李定琴等[68]介紹，故下面僅對2017年以來克隆的7個抗白葉枯病主效基因作簡要介紹。

Xa10從水稻品種Cas209中發(fā)現(xiàn)并定位于第11號染色體[26]，TIAN等[25]將其分離并發(fā)現(xiàn)編碼了126個含氨基酸蛋白，通過誘導消耗內質網上的Ca2+，誘導細胞程序性死亡，抵御病菌侵入；SUN等[19]將Xa4定位于第11號染色體47 kb區(qū)段上，HU等[59]在精細定位的基礎上將Xa4分離克隆并發(fā)現(xiàn)編碼細胞壁相關激酶(WAK)，能增強細胞壁進而增強了對Xoo的抵抗力，同時發(fā)現(xiàn)該基因增強水稻抗倒伏性，在實際生產當中被廣泛應用[69]；ZHANG等[48,70-71]過同源克隆和圖位克隆的方法分離克隆了Xa2、Xa14和Xa31(t)，發(fā)現(xiàn)Xa31(t)與Xa2是相同的基因，且發(fā)現(xiàn)Xa1，Xa2和Xa14之間的相互作用使得水稻表現(xiàn)出不同的抗病性，且至少存在一個由Xa1，Xa2和Xa14所組成的獨特基因座賦予了水稻抗病性。同期，JI等[63]克隆了Xa2，Xa31(t)，Xa14，CGS-Xo111和Xa45(t)，通過序列分析發(fā)現(xiàn)這些基因及其預測的蛋白質高度保守，形成一組Xa1等位基因，與ZHANG等[69]研究結果一致；Xa7由COHEN等[72]定位在水稻第6號染色體51 kb的區(qū)段上，梅樂[73]在此基礎上通過構建BAC文庫，比對水稻品種間的序列同源性，篩選出易感突變體，通過映射區(qū)域比對，將Xa7錨定在28 kb的區(qū)域中最終分離克?。粁a41(t)是HUTIN等[59]在OsSWEET14的啟動子中篩選并分離克隆，啟動子缺失的18 bp與其他幾個已知激活OsSWEET14基因的TAL效應子靶向的結合位點重疊，進而產生了對白葉枯病的抗性。

2.3 抗白葉枯病基因的功能類型

水稻抗白葉枯病基因編碼蛋白結構分為五類，即編碼受體激酶蛋白RLK的抗性基因，編碼NLR蛋白的抗性基因、編碼糖轉運蛋白SWEET基因、執(zhí)行基因和其他類型的基因。

受體激酶蛋白RLK是一類植物細胞膜表面的模式識別受體，是植物先天免疫系統(tǒng)的關鍵組成部分[74]。通常包含胞外結構域、單程跨膜結構域和胞內激酶結構域[69]。Xa21編碼的跨膜富亮氨酸重復序列LRR結構域能識別Xoo中的RaxX蛋白進而激發(fā)免疫反應[37]。Xa3/Xa26編碼蛋白的胞外的結構域由26個不完全的LRR組成，研究推測該基因編碼的LRR能夠識別Xoo中的特異蛋白而激發(fā)免疫反應[18,75]。Xa4[76]編碼由707個氨基酸組成的細胞壁相關激酶WAK，能將細胞壁與質膜連接起來，并把細胞外信號傳遞到細胞質，促進纖維素合成并抑制細胞壁松弛來增強細胞壁結構，進而增強了對Xoo的抵抗力[77]。

NLR蛋白是含有核苷酸結合結構域和富含亮氨酸重復序列的抗病蛋白，通常能識別病原菌的特定效應蛋白TAL來觸發(fā)小種特異性免疫反應。Xa1[16]編碼的NLR蛋白通過識別包括PthXo1、Tal4和Tal9d在內的幾種TAL效應子來賦予對Xoo的抗性[78]。近期被克隆的4個Xa1的等位基因Xa2、Xa14、Xa31(t)和Xa45，均編碼禾本科特有的NLR蛋白，這些基因互相協(xié)同作用，組成的獨特基因座能激發(fā)水稻對Xoo的抗性[63,69]。

SWEET家族蛋白是一類獨特的糖轉運蛋白，通過SWEET蛋白輸出到細胞質外體的糖會被病原體的TAL效應子劫持[79]。研究發(fā)現(xiàn)Xoo中的一種TAL效應器PthXo1直接靶向顯性基因Xa13效應子結合元件EBE，以誘導病原菌的表達，同時還能利用OsSWEET11蛋白協(xié)同其他銅轉運蛋白去除水稻木質部導管中的銅[80]，而xa13[29]編碼的SWEET蛋白不受Xoo誘導，木質部導管中的銅抑制了Xoo的生長，進而表現(xiàn)出抗病性。隱性基因xa25[41]編碼蛋白OsSWEET13相關抗病機理暫不明確。xa41(t)編碼蛋白對Xoo中兩種TAL效應器AvrXa7和Tal5的識別位點發(fā)生了缺失突變，進而產生抗性[59]。

執(zhí)行基因Executor是一類重要的抗白葉枯病基因，具有多個潛在的跨膜結構域作為啟動子陷阱，能被TAL效應子轉錄激活并觸發(fā)防御反應。Xa27能被攜帶AvrXa27效應器的Xoo特異性誘導，使水稻維管束細胞次生細胞壁變厚，抵御白葉枯病[44]。Xa23啟動子區(qū)域含有結合位點UPT[81]，因而擁有更廣的抗譜。Xa10[25-26]通過直接結合Xa10的啟動子特異性誘導AvrXa10表達。Xa7啟動子中存在效應子結合元件EBE能被AvrXa7或PthXo3誘導，進而激發(fā)Xa7產生免疫反應[72]。

TFIIAγ是一種特殊的轉錄因子能直接影響聚合酶的轉錄[82]?？拱兹~枯病基因xa5編碼突變的轉錄因子TFIIAγ5V39E，相比與TFIIAγ5/Xa5，xa5編碼的蛋白僅含有一處氨基酸突變[20]，xa5編碼的TFIIAγ5V39E阻礙了TFIIAγ5與TAL的結合，從而影響了白葉枯菌的侵染[83]。

3 水稻抗白葉枯病相關因子的研究

在植物抗病過程中，抗病基因發(fā)揮了關鍵性作用，同時大量抗病相關因子也參與抗病過程，這類因子正向或負向調控抗病反應，或者間接調控抗病基因，但因其調控的抗性水平相對較低，通常需要使用超量表達或者抑制表達的方法研究抗病相關因子[84]。對抗病相關因子的研究與利用，有助于更深入理解水稻抗病機制，增強水稻對白葉枯病的抗性并拓寬其抗譜。目前，水稻中編碼抗病相關因子的基因約有900個，其中至少30個基因編碼抗病因子從而影響Xoo的侵染[85]，下面僅列舉幾種常見的類型。

3.1 植物激素類抗病因子

生長素是一種重要的植物激素，也是植物抗病機制中的關鍵因子。吲哚-3-乙酸IAA是生長素的一種主要形式，外源施用IAA會增加水稻白葉枯病斑的面積[86]。植物GH3基因家族成員編碼的GH3蛋白能將IAA與氨基酸連接，從而使IAA失活。超量表達水稻OsGH3-2或OsGH3-8后，水稻體內游離生長素的含量下降，但是對白葉枯病產生了廣譜抗性[87-88]。

水楊酸通常在植物被Xoo侵染后合成，侵染的部分迅速合成水楊酸，使被侵染部分發(fā)生超敏反應，隨后通過維管束組織向其他的未被侵染的部分運輸，逐漸使整個植株獲得抗性。NPR1是擬南芥中一個重要基因，通過超量表達該基因在水稻中的同源基因NH1后，激活了水稻的防御反應，抑制白葉枯病菌的生長，推測該基因能夠直接結合水楊酸以單體的形式進入細胞核，并與相關的TGA轉錄因子互作[89]。

茉莉酸作為植物抗病反應的重要信號分子，能激活與植物抗病反應相關的防御保護機制，誘導植物產生對多種病害的系統(tǒng)獲得抗性[90]。KE[91]等發(fā)現(xiàn)水稻基因OsPAD4編碼一種質膜蛋白，能與植物體內游離的茉莉酸結合，增強水稻對Xoo的抗性。研究發(fā)現(xiàn)水楊酸信號通過誘導多種OsPIPs基因的表達，抑制白葉枯病菌侵染，提高水稻抗病性。

3.2 WRKY類轉錄因子編碼基因

WRKY轉錄因子是調節(jié)基因轉錄的蛋白質分子，廣泛參與植物各種生理過程。目前從水稻基因組中克隆和鑒定出WRKY基因至少有109個[92]，根據(jù)功能類型分為：響應生物脅迫類、響應非生物脅迫類、參與植物激素信號轉導類、參與植物的生長發(fā)育類。其中一部分響應生物脅迫類WRKY基因能通過多種方式調節(jié)植物對Xoo的免疫反應[93]，例如OsWRKY13[94]能影響類植物抗毒素——黃酮素的合成，超量表達該基因后發(fā)現(xiàn)對白葉枯病的抗性有所增強；WRKY30的超量表達增強了水稻對白葉枯病的抗性，并且該基因的轉錄物在受到水楊酸和茉莉酸的影響下迅速積累，推測該基因可能還與植物激素類抗病因子有協(xié)同關系[95]；WRKY45-1和WRKY45-2介導不同的防御信號傳導途徑，他們編碼的蛋白在抗病過程中發(fā)揮了相反的作用。OsWRKY45-1過表達的植株顯示出對白葉枯病的抗性隨著水楊酸和茉莉酸的積累增加增強，而WRKY45-2則與之相反[96]；WRKY6[97]正向調控水稻防御相關基因OsPR10a，通過直接與OsICS1啟動子結合，激活SA介導的調控通路，從而增強防御反應；WRKY62[98]負調控抗白葉枯病主效基因Xa21介導的抗性，水稻在白葉枯病菌感染后對防御相關基因的激活受到抑制。

3.3 sRNAs類抗病因子

sRNAs是一類長度在21～24 nt的非編碼小分子，參與基因轉錄后的表達調控，作用機制復雜。在植物體中，sRNAs對植物的生長發(fā)育、激素轉導、適應生物與非生物脅迫等生物進程具有重要作用，同時也參與調控植物的免疫反應?？拱兹~枯病相關的OsmiR1858a，其靶基因為OsHIN1，編碼一類特殊的sRNA，對該基因進行超量表達發(fā)現(xiàn)對Xoo表現(xiàn)出更強的抗性[99]。另外研究發(fā)現(xiàn)，植物除了可以利用RNA結合蛋白這一機制來調節(jié)自身免疫，還可以利用sRNA與蛋白互相作用來調節(jié)自身免疫，例如Bsr-k1基因能編碼一種TPR域蛋白，該蛋白通過與植物體內的miRNA相互作用，進而增強對Xoo的抗性[100]。

4 抗白葉枯病基因利用設想與展望

4.1 抗病新基因的發(fā)掘

目前已被發(fā)掘的抗白葉枯病基因約有1/3被定位于水稻第11號染色體上，如Xa4、Xa10、Xa21[19,26,38]等。因此，可以推斷水稻第11號染色體上應該還有很多新的抗白葉枯病基因，而基于高通量測序的信息解析技術以及基因編輯技術有望對第11號染色體上的基因進行挖掘和功能驗證，系統(tǒng)的解析抗病新基因。本實驗室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)一個來自云南耿馬縣的地方稻種毫糯揚中攜帶有新的抗白葉枯病基因Xa48(t)，該基因定位在第11號染色體長臂端的0.12 Mb區(qū)段內，挖掘該基因將為解析水稻抗病機制提供新的線索。

4.2 抗病新基因的克隆與利用

迄今，被克隆的抗白葉枯病基因有17個，僅占被報道抗病基因的1/3，仍有大量抗病基因未被克隆利用，有些被確定的抗病基因由于定位區(qū)間過大、候選基因復雜而難以被克隆。就現(xiàn)階段而言，可以利用多方法組合克隆目標基因，例如將圖位克隆與突變體篩選相結合克隆出了Xa7。而今后基于高通量測序的克隆技術有望對曾被出定位的基因進行更精細定位以及克隆，甚至對易感基因片段進行基因編輯與功能驗證，進而探究基因、蛋白的互作機理，加速水稻的抗病育種研究進程。

4.3 抗病基因與抗病相關因子的協(xié)同利用

目前發(fā)掘的抗白葉枯病相關因子30余個，不同家族之間的抗病因子互相影響，使水稻具有特異性或廣譜性的抗性。例如部分WRKY基因能調控水稻的PR基因，進而激活植物激素或者其他抗病因子[96]，多種抗病因子相互協(xié)同，編碼豐富的抗病產物，激發(fā)植物免疫反應。此外，抗病相關因子還受到主效抗病基因的影響，共同抵御Xoo的侵染，例如抗病基因Xa21編碼的XA21能與一個WRKY轉錄因子OsWRKY62結合，負向調控水稻抗病性[101]；此外，XA21還能與類生長素蛋白XB21互作，提高對Xoo的抗性[102]。但由于抗病相關因子數(shù)量多且功能復雜，編碼抗病相關因子的基因并未全部發(fā)掘與定位，今后有望利用多組學手段對編碼抗病因子的基因進行克隆鑒定，對抗病相關因子進行分類整理，與其他植物抗病相關基因進行橫向比較，研究其同源基因在其他植物上的功能特征，以期在植物大背景下深入研究對抗病相關因子與抗病基因的相互作用，通過抗病基因與抗病因子的綜合利用，選育出更持久廣譜的抗性品種。