自然高溫條件下百合葉綠素?zé)晒馓匦苑治?/h1>
2022-11-25 07:28:04陳敏敏聶功平楊柳燕張永春
中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 2022年29期
陳敏敏，聶功平，李 心，周 琳，楊柳燕，張永春
（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201403）
0 引言
百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)重要的球根類植物，已報(bào)道有55個(gè)種和18個(gè)變種分布于中國，其花色豐富，觀賞價(jià)值極高。隨著城市園林綠化的發(fā)展及花卉產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)，百合的消費(fèi)模式向小型盆栽、室外庭院裝飾及家庭園藝等消費(fèi)形式拓展。百合喜冷涼濕潤型氣候，而中國長江中下游以南地區(qū)夏季普遍存在高溫高濕等氣候因素，影響百合的生長發(fā)育和品質(zhì)，一定程度上制約了其園林景觀的應(yīng)用與家庭園藝推廣，因此，研究百合自然高溫逆境下的響應(yīng)機(jī)制和不同品種對(duì)高溫逆境的敏感性，對(duì)于提高百合耐熱性、保證植株正常越夏及選育耐熱性強(qiáng)的品種具有重要意義。
前人關(guān)于百合對(duì)高溫逆境研究已有部分報(bào)道，大多集中于提高種球耐熱性的方法、部分品種耐熱性生理指標(biāo)測(cè)定、EMS誘變選育耐熱品種及耐熱相關(guān)基因的挖掘與分子生物學(xué)研究，如劉雪凝等[1]以‘多安娜’為試材開展熱激鍛煉對(duì)亞洲百合耐熱性的誘導(dǎo)相關(guān)研究，推斷種球熱激鍛煉30 min為提高其耐熱性的有效時(shí)間；李蕊等[2]開展百合雜交種及其親本的耐熱性比較分析，結(jié)果表明‘細(xì)葉百合’大慶種源較承德種源的耐熱性強(qiáng)，雜交種的耐熱性與母本相近；劉艷妮等[3]開展35℃高溫條件下篩選‘鐵炮百合’EMS誘變后的耐熱突變體，較對(duì)照耐熱性增強(qiáng)；張銘順等[4]以東方百合雜種系‘西伯利亞’為材料研究表明高溫脅迫下，外源Ca2+能通過提高滲透調(diào)節(jié)能力、抗氧化能力、光合作用能力和蛋白活性來調(diào)節(jié)其對(duì)高溫逆境的適應(yīng)性；Xin等[5]、Wu等[6-7]克隆‘麝香百合’中的熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子HsfA2、HsfA3和DREB2-type，并在擬南芥中驗(yàn)證其相應(yīng)功能。在植物高溫逆境評(píng)價(jià)方面，張佳平等[8]利用隸屬函數(shù)法結(jié)合主成分分析法對(duì)10個(gè)芍藥品種的耐熱性展開評(píng)價(jià)，隸屬函數(shù)法是芍藥耐熱性評(píng)價(jià)簡便、直觀、有效的評(píng)價(jià)方法；王海珍等[9]采用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)對(duì)胡楊異形葉葉綠素?zé)晒馓匦詫?duì)高溫的響應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，表明鋸齒闊卵形葉的耐熱性最強(qiáng)。
高溫對(duì)植物生長發(fā)育的負(fù)面影響大，其中光合作用是植物面對(duì)脅迫時(shí)最為敏感的生理過程。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)在測(cè)定植物葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、分配等方面具有優(yōu)勢(shì)，已成為研究植物光合生理功能及各種逆境脅迫下鑒定評(píng)價(jià)植物抗性的理想技術(shù)[9-10]。不同植物在高溫脅迫情況下，其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、生理指標(biāo)及表型性狀均會(huì)隨著植物耐熱性的大小呈現(xiàn)差異，一般可以通過抗性基因表達(dá)分析、生理指標(biāo)的檢測(cè)及表型性狀的變化來鑒定不同植物品種的耐熱性。但由于抗性基因定量分析和生理指標(biāo)的檢測(cè)操作較復(fù)雜，尤其需要評(píng)價(jià)的品種較多時(shí)，需耗費(fèi)大量的人工和財(cái)力，因此，采用葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)建立簡單快速的耐熱性狀評(píng)價(jià)體系可在短時(shí)間內(nèi)針對(duì)大量品種進(jìn)行鑒定，方法簡便、快速、準(zhǔn)確。本研究在上海夏季自然高溫逆境條件下收集66個(gè)觀賞百合品種的葉綠素?zé)晒馓卣鲄?shù)，針對(duì)不同品種對(duì)自然高溫逆境的反應(yīng)進(jìn)行綜合分析和評(píng)價(jià)，以期對(duì)不同百合品種的高溫逆境敏感性開展評(píng)價(jià)，為百合高溫逆境響應(yīng)相關(guān)機(jī)理研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
本試驗(yàn)所用百合材料由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院收集保存，共計(jì)66份。包括包括LA(Longiflorum×Asiatic)系18份，LO(Longiflorum×Oriental)系2份，A(Asiatic)系18份，O(Oriental)系19份，OT(Oriental×Trumpet)系8份，LL(L.longiflorum×L.pardalinum)雜交系1份（表1），種球圍徑均為14～16 cm，材料分別于2019年4月30日種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院百合種質(zhì)資源圃，圃地位于31°14′16.56″N，121°05′44.88″E，北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫15.3～16.9℃，年降水量1104.4 mm。土壤有機(jī)質(zhì)2.555左右，土壤pH 6.5左右。試驗(yàn)材料種植于草炭基質(zhì)槽中，每平方米種植30～40個(gè)種球，田間管理和病蟲草害防治方法保持一致。選擇生長約90天的植株開展耐熱性評(píng)價(jià)。
1.2 試驗(yàn)方法
試驗(yàn)于2019年7月30日進(jìn)行，該段時(shí)間日平均氣溫為22～38℃，百合植株生長旺盛。于高溫日（7月30日）37℃、13:00—14:30對(duì)生育期約90天的植株進(jìn)行測(cè)定，采用連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Pocket Plant Efficiency Analyzer，英國Hansatech公司）測(cè)定葉片（整株自上而下第5片葉）的葉綠素快相熒光動(dòng)力學(xué)數(shù)，測(cè)定之前進(jìn)行20 min暗處理，OJIP曲線由3000 μmol/(m2/s)紅光誘導(dǎo),測(cè)定時(shí)間為1 s,測(cè)定Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo等7個(gè)指標(biāo)，每個(gè)處理測(cè)定6個(gè)重復(fù)。
1.3 高溫響應(yīng)評(píng)價(jià)
采用模糊隸屬函數(shù)法[11]，對(duì)37℃測(cè)定的不同的百合品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行分析，
并分別對(duì)每個(gè)指標(biāo)求隸屬函數(shù)值，計(jì)算見公式(1)～(3)。
公式中：Xi為各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax和Xmin分別為某項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。如果某一指標(biāo)性狀與高溫響應(yīng)呈正相關(guān)，則選用式(1)，若呈負(fù)相關(guān)則用式(2)；將各個(gè)指標(biāo)隸屬值進(jìn)行累加用式(3)。
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，R3.5.3軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，采用SPSS17.0進(jìn)行差異顯著性分析。
2 試驗(yàn)結(jié)果
2.1 試驗(yàn)期間氣溫變化情況
2019年7—9月上海氣溫最高為37～38℃，試驗(yàn)選擇高溫日（7月30日）37℃、13:00—14:30開展。
2.2 不同百合品種葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)自然高溫的響應(yīng)情況
2.2.1Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm指標(biāo)分析 由表1可知，在自然高溫條件下，‘Tresor’的Fo最高，為704.25，‘Tiny Double You’的Fo最低，為370.2。Fm為最大熒光值，是光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量，反映了光合作用過程中的電子傳遞情況，F(xiàn)m值越低，表明受高溫傷害的程度越高，植株越不耐熱。66份材料測(cè)定結(jié)果表明，‘Brindisi’的Fm值最低，為698.667，‘Armandale’的Fm值最高，為2454。Fv/Fo表示光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性，反映了PSⅡ的活性大小，F(xiàn)v/Fo值越低表明PSⅡ反應(yīng)中心受到傷害，耐熱性越差。表1結(jié)果表明，‘Triumphator’的Fv/Fo值最小，為 0.3633，‘Tribal Kiss’的Fv/Fo值最大，為3.9907。Fv/Fm為最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，表示PSⅡ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)換效率，F(xiàn)v/Fm高意味PSⅡ中心原初光能的轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，即對(duì)光能利用的潛力高[24]，由表2可知，‘Brindisi’的Fv/Fm值最小，為0.1993，‘Souvenir’的Fv/Fm值最大，為0.7775。
表1 不同百合品種Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo的高溫響應(yīng)表現(xiàn)
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
表2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)評(píng)價(jià)耐熱性
2.2.2PIABS、DIo/CSo、φEo指標(biāo)分析PIABS是以吸收光能為基礎(chǔ)的光化學(xué)性能指數(shù)，由表1可知，66個(gè)品種中‘Brindisi’的PIABS值 最 小 ，為 0.0313，‘Sunny Martinique’的PIABS值最大，為2.2294；DIo/CSo主要反映PSⅡ反應(yīng)中心以熱能消耗能量的比率，由表1可知，‘Souvenir’的DIo/CSo值最小，為109.1131，‘Tresor’的DIo/CSo值最大，為467.7201；φEo主要表示用于電子傳遞的量子產(chǎn)額，由表1可知，66個(gè)品種中‘Nashville’的φEo值最小，為0.0622，‘Merlet’的φEo值最大，為0.4714。
2.3 熒光參數(shù)指標(biāo)相關(guān)性分析
對(duì)66個(gè)品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。由圖1可知，F(xiàn)v/Fm與Fm、Fv/Fo、PIABS、DIo/CSo、φEo等指標(biāo)相關(guān)性極顯著，F(xiàn)v/Fm與Fo相關(guān)性顯著。其中Fv/Fm與Fm、Fv/Fo、PIABS、φEo呈極顯著正相關(guān)，F(xiàn)v/Fm與DIo/CSo呈極顯著負(fù)相關(guān)；Fv/Fm與Fo呈顯著負(fù)相關(guān)。
圖1 不同品種葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)參數(shù)的相關(guān)性
2.4 不同品種對(duì)自然高溫響應(yīng)的分析與評(píng)價(jià)
本研究發(fā)現(xiàn)Fv/Fm與檢測(cè)的其他6種指標(biāo)Fo、Fm、Fv/Fo、PIABS、DIo/CSo、φEo均顯著相關(guān)，因此對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行了模糊隸屬函數(shù)法分析，并進(jìn)行綜合指標(biāo)AR值排序（圖2、表2、表3）。據(jù)此，不同品種對(duì)自然高溫的響應(yīng)可分為5個(gè)級(jí)別，一級(jí)AR值為4.2859～5.4386，對(duì)高溫不敏感 ，其中‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’排名前3；二級(jí)AR值為3.9371～4.2821，其中‘Sheer Blonde’、‘Pearl Frances’、‘Roselily Monica’排名前3；三級(jí)AR值為3.6439～3.8968，其中‘Roselily Samantha’、‘Tiny Bee’、‘Siberia’排名前3；四級(jí)AR值為 3.0458～3.6428，其 中‘Sunny Keys’、‘Fusion’、‘White Twinkle’排名前3；五級(jí)AR值為1.4066～3.0079，對(duì)高溫敏感，其中‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’對(duì)高溫最敏感。
圖2 不同葉綠素?zé)晒鈪?shù)分類數(shù)的誤差函數(shù)
表3 不同分類數(shù)下66個(gè)品種的分類結(jié)果
3 討論與結(jié)論
3.1 自然高溫對(duì)百合葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
高溫會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)園藝植物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[12-13]，Gong等[14]報(bào)道高溫會(huì)引起球根類植物營養(yǎng)生長停滯和種球退化等現(xiàn)象。此外，高溫影響植物生理生化指標(biāo)的改變，如植物細(xì)胞壁中過氧化物酶和二胺類氧化酶積累、細(xì)胞膜脂中不飽和脂肪酸和鑲嵌蛋白含量的變化[15]、ABA/SA/BR/乙烯等植物激素的應(yīng)答及核酸結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)等的穩(wěn)定性[16]，不同品種對(duì)高溫的生理響應(yīng)機(jī)制不同造成品種間耐熱性的差異。不僅如此，高溫還會(huì)引起植物光合作用能力下降，尤其當(dāng)植物光合作用受到抑制，葉綠素光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)便會(huì)受影響[17]，在PSⅡ中，葉綠素?zé)晒馐且环N無損傷檢測(cè)植物受到逆境脅迫后光合系統(tǒng)響應(yīng)情況的技術(shù)，可以準(zhǔn)確反映光能吸收和傳遞過程，是研究植物光合生理及植物與逆境脅迫關(guān)系的理想指標(biāo)[18]，國內(nèi)外應(yīng)用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)開展植物抗逆性鑒定的研究越來越多，主要集中在高溫脅迫[19]、冷脅迫[20-21]、干旱脅迫[22]等方面，可以在避免對(duì)植物造成傷害的情況下分析植物光合參數(shù)的變化，目前已被廣泛應(yīng)用于葡萄[23-24]、蘋果[25]、水稻[26]、甘蔗[27]等園藝植物的抗性評(píng)價(jià)中，可以靈敏、快速、無損的完成抗性評(píng)價(jià)。本研究采用葉綠素?zé)晒鈪?shù)法測(cè)定百合品種在自然高溫下的Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo7個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)，反映了自然高溫下百合葉片對(duì)高溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，并將66個(gè)百合品種對(duì)自然高溫響應(yīng)的敏感性進(jìn)行等級(jí)劃分，因此測(cè)定百合品種的7個(gè)主要葉綠素?zé)晒鈪?shù)，為從生理層面了解不同百合品種葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)高溫的響應(yīng)機(jī)制提供參考。
3.2 自然高溫響應(yīng)評(píng)價(jià)方法的科學(xué)性
前人關(guān)于高溫脅迫的研究表明，高溫脅迫一般會(huì)導(dǎo)致葉片的光合速率下降，F(xiàn)v/Fm值下降[28]，F(xiàn)v/Fm是反映PSⅡ光化學(xué)效率的敏感指標(biāo)，一般植物葉片中葉綠素a的原初光化學(xué)效率較高，F(xiàn)v/Fm值在0.80～0.85之間，值越低則表明植物受到的傷害越大，對(duì)熱傷害越敏感。不同百合品種適宜生長溫度一般低于28℃，不同品種略有差異，如‘亞洲百合’雜種系最適溫度為白天維持在20℃～25℃，夜間8℃～10℃；‘東方百合’雜種系生根后最適溫度為15℃～17℃，陽光充足時(shí)可以忍受20℃～22℃，甚至25℃。‘鐵炮百合’生根后的最佳生長溫度為14℃～16℃，陽光充足時(shí)可以忍受20℃～22℃[29]，本研究為提高葉綠素?zé)晒馓卣鲄?shù)測(cè)定的準(zhǔn)確性，選取采用同樣生育期的植株，在高溫日條件下盡量短的時(shí)間快速完成大量樣本的測(cè)定，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果表明自然高溫環(huán)境下Fv/Fm值為0.20～0.78不等，同一品種較正常溫度對(duì)照下測(cè)定的Fv/Fm值均出現(xiàn)不同程度的下降，說明高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致百合葉片的Fv/Fm值顯著降低，抑制了百合的光能轉(zhuǎn)化效率，這一結(jié)果與前人報(bào)道一致[19,24]，也說明自然高溫37℃下測(cè)定百合葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)具有參考性。
3.3 不同百合品種對(duì)自然高溫響應(yīng)鑒定結(jié)果及應(yīng)用
鑒定結(jié)果表明不同百合組與雜交種、單重瓣類型在自然高溫下的高溫敏感性無明顯相關(guān)性，如鑒定的18個(gè)亞洲百合和19個(gè)東方百合品種中5個(gè)等級(jí)均有，18個(gè)LA雜種系百合分別屬于一、三、四、五級(jí)，7個(gè)OT雜種系百合分別屬于一、三、五級(jí)；2個(gè)LO雜種系均為五級(jí)；1個(gè)LL系為四級(jí)。鑒定出‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’、‘Sunny Martinique’、‘Methone’等25個(gè)品種為高溫不敏感的百合品種，‘Zambesi’、‘Triumphator’、‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’等 19個(gè)品種為高溫敏感的品種，這一結(jié)果為百合耐熱性相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
3.4 結(jié)論
本研究以66份觀賞百合種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，開展葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)自然高溫的響應(yīng)研究，并采用模糊隸屬函數(shù)法結(jié)合有序樣本最優(yōu)分割聚類法分析自然高溫下不同品種的Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo等7個(gè)指標(biāo)，比較不同品種百合對(duì)自然高溫逆境響應(yīng)的敏感程度。結(jié)果表明，66份百合種質(zhì)資源的Fv/Fm值在自然高溫逆境下均受影響，采用隸屬函數(shù)和有序樣本最優(yōu)分割聚類法將種質(zhì)資源分為五個(gè)等級(jí) ，‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’、‘Sunny Martinique’、‘Methone’等25個(gè)品種為一級(jí)，對(duì)高溫逆境不敏感 ，適應(yīng)性強(qiáng) ；‘Zambesi’、‘Triumphator’、‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’等 19 個(gè)品種為五級(jí)，對(duì)高溫逆境較敏感，適應(yīng)性差。本研究建立了適宜百合品種高溫響應(yīng)評(píng)價(jià)的方法，篩選對(duì)自然高溫響應(yīng)敏感與不敏感的百合品種，為進(jìn)一步開展耐熱相關(guān)機(jī)理研究和耐熱品種選育提供參考。
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0 引言
百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)重要的球根類植物，已報(bào)道有55個(gè)種和18個(gè)變種分布于中國，其花色豐富，觀賞價(jià)值極高。隨著城市園林綠化的發(fā)展及花卉產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)，百合的消費(fèi)模式向小型盆栽、室外庭院裝飾及家庭園藝等消費(fèi)形式拓展。百合喜冷涼濕潤型氣候，而中國長江中下游以南地區(qū)夏季普遍存在高溫高濕等氣候因素，影響百合的生長發(fā)育和品質(zhì)，一定程度上制約了其園林景觀的應(yīng)用與家庭園藝推廣，因此，研究百合自然高溫逆境下的響應(yīng)機(jī)制和不同品種對(duì)高溫逆境的敏感性，對(duì)于提高百合耐熱性、保證植株正常越夏及選育耐熱性強(qiáng)的品種具有重要意義。
前人關(guān)于百合對(duì)高溫逆境研究已有部分報(bào)道，大多集中于提高種球耐熱性的方法、部分品種耐熱性生理指標(biāo)測(cè)定、EMS誘變選育耐熱品種及耐熱相關(guān)基因的挖掘與分子生物學(xué)研究，如劉雪凝等[1]以‘多安娜’為試材開展熱激鍛煉對(duì)亞洲百合耐熱性的誘導(dǎo)相關(guān)研究，推斷種球熱激鍛煉30 min為提高其耐熱性的有效時(shí)間；李蕊等[2]開展百合雜交種及其親本的耐熱性比較分析，結(jié)果表明‘細(xì)葉百合’大慶種源較承德種源的耐熱性強(qiáng)，雜交種的耐熱性與母本相近；劉艷妮等[3]開展35℃高溫條件下篩選‘鐵炮百合’EMS誘變后的耐熱突變體，較對(duì)照耐熱性增強(qiáng)；張銘順等[4]以東方百合雜種系‘西伯利亞’為材料研究表明高溫脅迫下，外源Ca2+能通過提高滲透調(diào)節(jié)能力、抗氧化能力、光合作用能力和蛋白活性來調(diào)節(jié)其對(duì)高溫逆境的適應(yīng)性；Xin等[5]、Wu等[6-7]克隆‘麝香百合’中的熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子HsfA2、HsfA3和DREB2-type，并在擬南芥中驗(yàn)證其相應(yīng)功能。在植物高溫逆境評(píng)價(jià)方面，張佳平等[8]利用隸屬函數(shù)法結(jié)合主成分分析法對(duì)10個(gè)芍藥品種的耐熱性展開評(píng)價(jià)，隸屬函數(shù)法是芍藥耐熱性評(píng)價(jià)簡便、直觀、有效的評(píng)價(jià)方法；王海珍等[9]采用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)對(duì)胡楊異形葉葉綠素?zé)晒馓匦詫?duì)高溫的響應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，表明鋸齒闊卵形葉的耐熱性最強(qiáng)。
高溫對(duì)植物生長發(fā)育的負(fù)面影響大，其中光合作用是植物面對(duì)脅迫時(shí)最為敏感的生理過程。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)在測(cè)定植物葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、分配等方面具有優(yōu)勢(shì)，已成為研究植物光合生理功能及各種逆境脅迫下鑒定評(píng)價(jià)植物抗性的理想技術(shù)[9-10]。不同植物在高溫脅迫情況下，其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、生理指標(biāo)及表型性狀均會(huì)隨著植物耐熱性的大小呈現(xiàn)差異，一般可以通過抗性基因表達(dá)分析、生理指標(biāo)的檢測(cè)及表型性狀的變化來鑒定不同植物品種的耐熱性。但由于抗性基因定量分析和生理指標(biāo)的檢測(cè)操作較復(fù)雜，尤其需要評(píng)價(jià)的品種較多時(shí)，需耗費(fèi)大量的人工和財(cái)力，因此，采用葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)建立簡單快速的耐熱性狀評(píng)價(jià)體系可在短時(shí)間內(nèi)針對(duì)大量品種進(jìn)行鑒定，方法簡便、快速、準(zhǔn)確。本研究在上海夏季自然高溫逆境條件下收集66個(gè)觀賞百合品種的葉綠素?zé)晒馓卣鲄?shù)，針對(duì)不同品種對(duì)自然高溫逆境的反應(yīng)進(jìn)行綜合分析和評(píng)價(jià)，以期對(duì)不同百合品種的高溫逆境敏感性開展評(píng)價(jià)，為百合高溫逆境響應(yīng)相關(guān)機(jī)理研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
本試驗(yàn)所用百合材料由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院收集保存，共計(jì)66份。包括包括LA(Longiflorum×Asiatic)系18份，LO(Longiflorum×Oriental)系2份，A(Asiatic)系18份，O(Oriental)系19份，OT(Oriental×Trumpet)系8份，LL(L.longiflorum×L.pardalinum)雜交系1份（表1），種球圍徑均為14～16 cm，材料分別于2019年4月30日種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院百合種質(zhì)資源圃，圃地位于31°14′16.56″N，121°05′44.88″E，北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫15.3～16.9℃，年降水量1104.4 mm。土壤有機(jī)質(zhì)2.555左右，土壤pH 6.5左右。試驗(yàn)材料種植于草炭基質(zhì)槽中，每平方米種植30～40個(gè)種球，田間管理和病蟲草害防治方法保持一致。選擇生長約90天的植株開展耐熱性評(píng)價(jià)。
1.2 試驗(yàn)方法
試驗(yàn)于2019年7月30日進(jìn)行，該段時(shí)間日平均氣溫為22～38℃，百合植株生長旺盛。于高溫日（7月30日）37℃、13:00—14:30對(duì)生育期約90天的植株進(jìn)行測(cè)定，采用連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Pocket Plant Efficiency Analyzer，英國Hansatech公司）測(cè)定葉片（整株自上而下第5片葉）的葉綠素快相熒光動(dòng)力學(xué)數(shù)，測(cè)定之前進(jìn)行20 min暗處理，OJIP曲線由3000 μmol/(m2/s)紅光誘導(dǎo),測(cè)定時(shí)間為1 s,測(cè)定Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo等7個(gè)指標(biāo)，每個(gè)處理測(cè)定6個(gè)重復(fù)。
1.3 高溫響應(yīng)評(píng)價(jià)
采用模糊隸屬函數(shù)法[11]，對(duì)37℃測(cè)定的不同的百合品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行分析，
并分別對(duì)每個(gè)指標(biāo)求隸屬函數(shù)值，計(jì)算見公式(1)～(3)。
公式中：Xi為各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax和Xmin分別為某項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。如果某一指標(biāo)性狀與高溫響應(yīng)呈正相關(guān)，則選用式(1)，若呈負(fù)相關(guān)則用式(2)；將各個(gè)指標(biāo)隸屬值進(jìn)行累加用式(3)。
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，R3.5.3軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，采用SPSS17.0進(jìn)行差異顯著性分析。
2 試驗(yàn)結(jié)果
2.1 試驗(yàn)期間氣溫變化情況
2019年7—9月上海氣溫最高為37～38℃，試驗(yàn)選擇高溫日（7月30日）37℃、13:00—14:30開展。
2.2 不同百合品種葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)自然高溫的響應(yīng)情況
2.2.1Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm指標(biāo)分析 由表1可知，在自然高溫條件下，‘Tresor’的Fo最高，為704.25，‘Tiny Double You’的Fo最低，為370.2。Fm為最大熒光值，是光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量，反映了光合作用過程中的電子傳遞情況，F(xiàn)m值越低，表明受高溫傷害的程度越高，植株越不耐熱。66份材料測(cè)定結(jié)果表明，‘Brindisi’的Fm值最低，為698.667，‘Armandale’的Fm值最高，為2454。Fv/Fo表示光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性，反映了PSⅡ的活性大小，F(xiàn)v/Fo值越低表明PSⅡ反應(yīng)中心受到傷害，耐熱性越差。表1結(jié)果表明，‘Triumphator’的Fv/Fo值最小，為 0.3633，‘Tribal Kiss’的Fv/Fo值最大，為3.9907。Fv/Fm為最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，表示PSⅡ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)換效率，F(xiàn)v/Fm高意味PSⅡ中心原初光能的轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，即對(duì)光能利用的潛力高[24]，由表2可知，‘Brindisi’的Fv/Fm值最小，為0.1993，‘Souvenir’的Fv/Fm值最大，為0.7775。
表1 不同百合品種Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo的高溫響應(yīng)表現(xiàn)
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
表2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)評(píng)價(jià)耐熱性
2.2.2PIABS、DIo/CSo、φEo指標(biāo)分析PIABS是以吸收光能為基礎(chǔ)的光化學(xué)性能指數(shù)，由表1可知，66個(gè)品種中‘Brindisi’的PIABS值 最 小 ，為 0.0313，‘Sunny Martinique’的PIABS值最大，為2.2294；DIo/CSo主要反映PSⅡ反應(yīng)中心以熱能消耗能量的比率，由表1可知，‘Souvenir’的DIo/CSo值最小，為109.1131，‘Tresor’的DIo/CSo值最大，為467.7201；φEo主要表示用于電子傳遞的量子產(chǎn)額，由表1可知，66個(gè)品種中‘Nashville’的φEo值最小，為0.0622，‘Merlet’的φEo值最大，為0.4714。
2.3 熒光參數(shù)指標(biāo)相關(guān)性分析
對(duì)66個(gè)品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。由圖1可知，F(xiàn)v/Fm與Fm、Fv/Fo、PIABS、DIo/CSo、φEo等指標(biāo)相關(guān)性極顯著，F(xiàn)v/Fm與Fo相關(guān)性顯著。其中Fv/Fm與Fm、Fv/Fo、PIABS、φEo呈極顯著正相關(guān)，F(xiàn)v/Fm與DIo/CSo呈極顯著負(fù)相關(guān)；Fv/Fm與Fo呈顯著負(fù)相關(guān)。
圖1 不同品種葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)參數(shù)的相關(guān)性
2.4 不同品種對(duì)自然高溫響應(yīng)的分析與評(píng)價(jià)
本研究發(fā)現(xiàn)Fv/Fm與檢測(cè)的其他6種指標(biāo)Fo、Fm、Fv/Fo、PIABS、DIo/CSo、φEo均顯著相關(guān)，因此對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行了模糊隸屬函數(shù)法分析，并進(jìn)行綜合指標(biāo)AR值排序（圖2、表2、表3）。據(jù)此，不同品種對(duì)自然高溫的響應(yīng)可分為5個(gè)級(jí)別，一級(jí)AR值為4.2859～5.4386，對(duì)高溫不敏感 ，其中‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’排名前3；二級(jí)AR值為3.9371～4.2821，其中‘Sheer Blonde’、‘Pearl Frances’、‘Roselily Monica’排名前3；三級(jí)AR值為3.6439～3.8968，其中‘Roselily Samantha’、‘Tiny Bee’、‘Siberia’排名前3；四級(jí)AR值為 3.0458～3.6428，其 中‘Sunny Keys’、‘Fusion’、‘White Twinkle’排名前3；五級(jí)AR值為1.4066～3.0079，對(duì)高溫敏感，其中‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’對(duì)高溫最敏感。
圖2 不同葉綠素?zé)晒鈪?shù)分類數(shù)的誤差函數(shù)
表3 不同分類數(shù)下66個(gè)品種的分類結(jié)果
3 討論與結(jié)論
3.1 自然高溫對(duì)百合葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
高溫會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)園藝植物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[12-13]，Gong等[14]報(bào)道高溫會(huì)引起球根類植物營養(yǎng)生長停滯和種球退化等現(xiàn)象。此外，高溫影響植物生理生化指標(biāo)的改變，如植物細(xì)胞壁中過氧化物酶和二胺類氧化酶積累、細(xì)胞膜脂中不飽和脂肪酸和鑲嵌蛋白含量的變化[15]、ABA/SA/BR/乙烯等植物激素的應(yīng)答及核酸結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)等的穩(wěn)定性[16]，不同品種對(duì)高溫的生理響應(yīng)機(jī)制不同造成品種間耐熱性的差異。不僅如此，高溫還會(huì)引起植物光合作用能力下降，尤其當(dāng)植物光合作用受到抑制，葉綠素光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)便會(huì)受影響[17]，在PSⅡ中，葉綠素?zé)晒馐且环N無損傷檢測(cè)植物受到逆境脅迫后光合系統(tǒng)響應(yīng)情況的技術(shù)，可以準(zhǔn)確反映光能吸收和傳遞過程，是研究植物光合生理及植物與逆境脅迫關(guān)系的理想指標(biāo)[18]，國內(nèi)外應(yīng)用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)開展植物抗逆性鑒定的研究越來越多，主要集中在高溫脅迫[19]、冷脅迫[20-21]、干旱脅迫[22]等方面，可以在避免對(duì)植物造成傷害的情況下分析植物光合參數(shù)的變化，目前已被廣泛應(yīng)用于葡萄[23-24]、蘋果[25]、水稻[26]、甘蔗[27]等園藝植物的抗性評(píng)價(jià)中，可以靈敏、快速、無損的完成抗性評(píng)價(jià)。本研究采用葉綠素?zé)晒鈪?shù)法測(cè)定百合品種在自然高溫下的Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo7個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)，反映了自然高溫下百合葉片對(duì)高溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，并將66個(gè)百合品種對(duì)自然高溫響應(yīng)的敏感性進(jìn)行等級(jí)劃分，因此測(cè)定百合品種的7個(gè)主要葉綠素?zé)晒鈪?shù)，為從生理層面了解不同百合品種葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)高溫的響應(yīng)機(jī)制提供參考。
3.2 自然高溫響應(yīng)評(píng)價(jià)方法的科學(xué)性
前人關(guān)于高溫脅迫的研究表明，高溫脅迫一般會(huì)導(dǎo)致葉片的光合速率下降，F(xiàn)v/Fm值下降[28]，F(xiàn)v/Fm是反映PSⅡ光化學(xué)效率的敏感指標(biāo)，一般植物葉片中葉綠素a的原初光化學(xué)效率較高，F(xiàn)v/Fm值在0.80～0.85之間，值越低則表明植物受到的傷害越大，對(duì)熱傷害越敏感。不同百合品種適宜生長溫度一般低于28℃，不同品種略有差異，如‘亞洲百合’雜種系最適溫度為白天維持在20℃～25℃，夜間8℃～10℃；‘東方百合’雜種系生根后最適溫度為15℃～17℃，陽光充足時(shí)可以忍受20℃～22℃，甚至25℃。‘鐵炮百合’生根后的最佳生長溫度為14℃～16℃，陽光充足時(shí)可以忍受20℃～22℃[29]，本研究為提高葉綠素?zé)晒馓卣鲄?shù)測(cè)定的準(zhǔn)確性，選取采用同樣生育期的植株，在高溫日條件下盡量短的時(shí)間快速完成大量樣本的測(cè)定，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果表明自然高溫環(huán)境下Fv/Fm值為0.20～0.78不等，同一品種較正常溫度對(duì)照下測(cè)定的Fv/Fm值均出現(xiàn)不同程度的下降，說明高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致百合葉片的Fv/Fm值顯著降低，抑制了百合的光能轉(zhuǎn)化效率，這一結(jié)果與前人報(bào)道一致[19,24]，也說明自然高溫37℃下測(cè)定百合葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)具有參考性。
3.3 不同百合品種對(duì)自然高溫響應(yīng)鑒定結(jié)果及應(yīng)用
鑒定結(jié)果表明不同百合組與雜交種、單重瓣類型在自然高溫下的高溫敏感性無明顯相關(guān)性，如鑒定的18個(gè)亞洲百合和19個(gè)東方百合品種中5個(gè)等級(jí)均有，18個(gè)LA雜種系百合分別屬于一、三、四、五級(jí)，7個(gè)OT雜種系百合分別屬于一、三、五級(jí)；2個(gè)LO雜種系均為五級(jí)；1個(gè)LL系為四級(jí)。鑒定出‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’、‘Sunny Martinique’、‘Methone’等25個(gè)品種為高溫不敏感的百合品種，‘Zambesi’、‘Triumphator’、‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’等 19個(gè)品種為高溫敏感的品種，這一結(jié)果為百合耐熱性相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
3.4 結(jié)論
本研究以66份觀賞百合種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，開展葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)自然高溫的響應(yīng)研究，并采用模糊隸屬函數(shù)法結(jié)合有序樣本最優(yōu)分割聚類法分析自然高溫下不同品種的Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、PIABS、DIo/CSo、φEo等7個(gè)指標(biāo)，比較不同品種百合對(duì)自然高溫逆境響應(yīng)的敏感程度。結(jié)果表明，66份百合種質(zhì)資源的Fv/Fm值在自然高溫逆境下均受影響，采用隸屬函數(shù)和有序樣本最優(yōu)分割聚類法將種質(zhì)資源分為五個(gè)等級(jí) ，‘Souvenir’、‘Merlet’、‘Conca D'Or’、‘Sunny Martinique’、‘Methone’等25個(gè)品種為一級(jí)，對(duì)高溫逆境不敏感 ，適應(yīng)性強(qiáng) ；‘Zambesi’、‘Triumphator’、‘Nashville’、‘Brindisi’、‘Tresor’等 19 個(gè)品種為五級(jí)，對(duì)高溫逆境較敏感，適應(yīng)性差。本研究建立了適宜百合品種高溫響應(yīng)評(píng)價(jià)的方法，篩選對(duì)自然高溫響應(yīng)敏感與不敏感的百合品種，為進(jìn)一步開展耐熱相關(guān)機(jī)理研究和耐熱品種選育提供參考。
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