輝麗麗，李成會(huì)

(唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

0 引言

動(dòng)物生命活動(dòng)的存在與延續(xù)均依賴于有氧代謝，而絕大多數(shù)動(dòng)物氧氣的運(yùn)輸都需要借助體內(nèi)特殊的運(yùn)載蛋白來參與，這類參與呼吸作用的蛋白質(zhì)家族就是呼吸蛋白。血紅蛋白是存在于脊索動(dòng)物和部分軟體及節(jié)肢動(dòng)物中的一種呼吸蛋白[1]，它與血藍(lán)蛋白和蚯蚓血紅蛋白并稱為動(dòng)物界中的3種呼吸蛋白[2]。血藍(lán)蛋白的呼吸功能與血紅蛋白相似，但其分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制存在顯著差異。血藍(lán)蛋白是一種多功能蛋白，存在于某些軟體動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物的血淋巴中。研究表明，該蛋白與能量的貯存、滲透壓的維持及蛻皮過程的調(diào)節(jié)等多種生理生化功能有關(guān)[3]。

1 血藍(lán)蛋白的分布與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

血藍(lán)蛋白是一種含銅的呼吸蛋白，目前已知血藍(lán)蛋白存在于某些節(jié)肢動(dòng)物與軟體動(dòng)物血淋巴中。血藍(lán)蛋白含有2個(gè)直接連接多肽鏈的亞銅離子，易與氧結(jié)合，但在一定條件下也易與結(jié)合的氧進(jìn)行解離，是唯一可與氧進(jìn)行可逆結(jié)合的銅蛋白，與氧結(jié)合時(shí)呈現(xiàn)青藍(lán)色，而在脫氧狀態(tài)下則呈現(xiàn)無色[4]。

1.1 節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白的分布及特點(diǎn)

節(jié)肢動(dòng)物門的甲殼亞門、多足亞門、螯肢亞門和六足亞門中均含有血藍(lán)蛋白。在甲殼動(dòng)物中血藍(lán)蛋白一直被認(rèn)為僅存在于軟甲亞綱，但研究表明槳足綱中也存在血藍(lán)蛋白；多足動(dòng)物和六足動(dòng)物具有發(fā)達(dá)的氣管系統(tǒng)，曾被認(rèn)為血淋巴系統(tǒng)中不存在血藍(lán)蛋白，但研究證實(shí)，蜈蚣類的2種蚰蜒和很多昆蟲的血淋巴系統(tǒng)中也存在血藍(lán)蛋白，在倍足綱的異蛩科中也發(fā)現(xiàn)了血藍(lán)蛋白的存在；在螯肢亞門中，血藍(lán)蛋白較早地發(fā)現(xiàn)于蛛形綱的蜘蛛，劍尾類的鱟和蝎類[5-6]。

目前已知節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白超家族主要由酚氧化酶、擬血藍(lán)蛋白、昆蟲儲(chǔ)藏蛋白及昆蟲儲(chǔ)藏蛋白受體等成員組成[5]。節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)為六聚體或以六聚體為單位構(gòu)成的復(fù)合六聚體。典型的節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白由630～660個(gè)氨基酸構(gòu)成，其相對(duì)分子質(zhì)量為70～80 kD，并分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域：第一個(gè)結(jié)構(gòu)域主要有α螺旋構(gòu)成，其主要包括N端的150～180個(gè)氨基酸，依靠超二級(jí)結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定的螺旋束；第二個(gè)結(jié)構(gòu)域則包括2個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)：Cu A和Cu B，這2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均有2個(gè)α螺旋組成，且在每個(gè)α螺旋中通過3個(gè)組氨酸殘基與銅離子結(jié)合；第三個(gè)結(jié)構(gòu)域位于C端主要由β折疊組成，并進(jìn)一步折疊為超二級(jí)結(jié)構(gòu)形成7股反向平行β桶結(jié)構(gòu)[5-6]。

1.2 軟體動(dòng)物血藍(lán)蛋白的分布及特點(diǎn)

與節(jié)肢動(dòng)物相比軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白分布較為局限，目前，僅在頭足類和腹足類中發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白。軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白不與血細(xì)胞直接結(jié)合而是在血淋巴中懸浮存在，隨著血淋巴的循環(huán)遍布全身提供氧氣，軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白是自然界中最大的呼吸蛋白，結(jié)構(gòu)復(fù)雜[7]。大部分軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白由分子量大小為400 kD的亞基構(gòu)成并形成圓柱體；少部分軟體動(dòng)物如腹足綱和原鰓亞綱的血藍(lán)蛋白由2個(gè)十聚體聚合形成二十聚體；還有一些種類以十聚體為單位聚合形成多十聚體并進(jìn)一步呈現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)；頭足綱和多板綱的血藍(lán)蛋白以單一十聚體形式存在[8-9]。

研究人員利用冷凍電鏡技術(shù)獲得了軟體動(dòng)物鮑魚的清晰血藍(lán)蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用X晶體衍射技術(shù)發(fā)現(xiàn)軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量最大可達(dá)450 000Da，由7～8個(gè)大小相似(50 000Da)的功能單位(FU)組成，依次命名為a-h，氨基酸C端位于FU-h上，但頭足綱如鸚鵡螺血藍(lán)蛋白中血藍(lán)蛋白FU-h消失[10]。功能單位(Fu)由2個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即含有銅離子活性位點(diǎn)的α螺旋域和β折疊域。α螺旋域螯合1對(duì)銅離子，可結(jié)合1個(gè)O2；β折疊域可能含有Ca，維持四級(jí)結(jié)構(gòu)；α螺旋域與節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ具有相似功能，β折疊域則與節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ相類似[8]。

軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白模型顯示血藍(lán)蛋白由8個(gè)功能單位(Fu)組成，由核心結(jié)構(gòu)和外壁構(gòu)成。 模型核心結(jié)構(gòu)內(nèi)包括由2個(gè)同源的功能單位h構(gòu)成的領(lǐng)(頭足類中無領(lǐng)結(jié)構(gòu))，由功能單位g組成的拱，拱外為功能單位e、f，上述三部分共同構(gòu)成核心結(jié)構(gòu)。功能單位a、b、c和d構(gòu)成圓柱體外壁，兩個(gè)外壁反向組成二聚體，再由5個(gè)該種二聚體構(gòu)成十聚體血藍(lán)蛋白[8，10]。

2 血藍(lán)蛋白的生理生化功能

一般認(rèn)為，血藍(lán)蛋白與生物機(jī)體運(yùn)輸氧相關(guān)，但近年來研究表明，血藍(lán)蛋白是一種多功能蛋白，除參與機(jī)體運(yùn)輸氧以外還與機(jī)體能量的儲(chǔ)存和滲透壓平衡以及蛻皮相關(guān)，血藍(lán)蛋白還是節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物的重要免疫物質(zhì)，血藍(lán)蛋白存在酚氧化酶活性和抗菌性。

2.1 輸氧功能

血藍(lán)蛋白是以一價(jià)銅離子為主要作用離子的蛋白，氧與亞銅離子結(jié)合形成氧合血藍(lán)蛋白呈現(xiàn)藍(lán)色，脫氧血藍(lán)蛋白呈現(xiàn)無色。研究發(fā)現(xiàn)龍蝦血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ中的雙銅活性中心，2個(gè)銅離子分別與3個(gè)組氨酸殘基的咪唑氮配位，未與氧結(jié)合時(shí)，2個(gè)銅離子間相距46 pm，相互間作用力小，銅離子與3個(gè)組氨酸殘基咪唑氮之間配位呈現(xiàn)三角形，在2個(gè)銅離子間未見蛋白質(zhì)本身提供的橋基；結(jié)合氧后，Cu(Ⅱ)位于四配位或五配位，2個(gè)銅離子與2個(gè)氧原子，在一個(gè)近似的平面上，2個(gè)銅離子均呈現(xiàn)平面正方形的構(gòu)象，這種配位是對(duì)Cu(Ⅱ)最有利的。此時(shí)Cu(Ⅱ)依靠氧原子間形成的過氧橋連接，兩者相距36 pm[3]。

許澤立[11]報(bào)道，以東亞飛蝗為研究對(duì)象，通過酶改變?nèi)芙庋鯘舛鹊姆椒?，采用極譜熒光法檢驗(yàn)出東亞飛蝗卵和成蟲血淋巴的氧結(jié)合性質(zhì)。并利用PCR技術(shù)和基因重組技術(shù)研究了東亞飛蝗血藍(lán)蛋白的氧結(jié)合活性。王香香等[12]研究發(fā)現(xiàn)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同階段的意大利蝗卵以及1齡蝗蝻的血藍(lán)蛋白2個(gè)基因Hc1和Hc2的表達(dá)量，結(jié)果表明血藍(lán)蛋白亞基基因Hc1和Hc2在整個(gè)意大利蝗卵發(fā)育過程均有表達(dá)，且具有階段特異性。Hc1與Hc2協(xié)同作用為蝗卵發(fā)育供氧，其中，Hc1主要負(fù)責(zé)蝗卵滯育后發(fā)育期間的氧氣運(yùn)載，而Hc2主要維持滯育期間的氧氣運(yùn)載，且載氧效率較低。

2.2 抗病毒功能

無論節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白還是軟體動(dòng)物血藍(lán)蛋白均具有抗病毒活性。Zhang Y L等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將斑節(jié)對(duì)蝦血清中2種能夠分別與白斑桿狀病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)和石斑魚虹彩病毒(Singapore Grouper Iridovirus，SGIV)結(jié)合的血藍(lán)蛋白與病毒混合培養(yǎng)3 d，細(xì)胞所受傷害不大；而不含血藍(lán)蛋白的對(duì)照組細(xì)胞完全裂解。進(jìn)一步研究表明血藍(lán)蛋白在低濃度的情況下對(duì)病毒起到抑制作用，但并不能完全抑制病毒的復(fù)制。Lei K Y等[14]研究發(fā)現(xiàn)，日本對(duì)蝦的血藍(lán)蛋白對(duì)白斑桿狀病毒(White Spot Syndrome Virus ，WSSV)也表現(xiàn)出免疫活性。日本對(duì)蝦血藍(lán)蛋白的2個(gè)分子PjHcL亞基(75 ku)和 PjHcY亞基(73 ku)中的PjHcL亞基表現(xiàn)出抗病毒活性，而PjHcY亞基的抗病毒活性不明顯。Nesterova等[15]和 Zagorodnya等[16]研究發(fā)現(xiàn)，軟體動(dòng)物脈紅螺血藍(lán)蛋白和亮大蝸牛血藍(lán)蛋白對(duì)皰疹病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)均表現(xiàn)出免疫活性。而Dolashka等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，脈紅螺血藍(lán)蛋白的糖基化亞基RvH-C對(duì)呼吸道合胞體病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)具有免疫活性，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)另一亞基RvH2-e的寡糖序列與血藍(lán)蛋白的抗病毒活性具有密切關(guān)系。

2.3 抑菌作用

血藍(lán)蛋白能夠通過自身裂解產(chǎn)生對(duì)微生物具有抗性作用的肽類物質(zhì)，從而產(chǎn)生對(duì)該種微生物的抑制作用。Zhang Y L等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在凡納對(duì)蝦的血清中所存在的血藍(lán)蛋白是一種能夠與羊抗人IgG發(fā)生特異性反應(yīng)的IgG樣蛋白，血藍(lán)蛋白中存在Ig保守區(qū)，這些保守區(qū)域很有可能具有一定抗菌的功能。張澤蕙等[19]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦受到副溶血狐菌侵染后，其血淋巴中的具有5個(gè)分子量為6～31kD的兔抗血藍(lán)蛋白抗體，其中分子量為6kD的肽段與凡納濱對(duì)蝦的血藍(lán)蛋白具有同源性，并且對(duì)細(xì)菌具有明顯的抑制作用。而李長(zhǎng)平等[20]報(bào)道，凡納濱對(duì)蝦的血藍(lán)蛋白及 6 種源于凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白的化學(xué)合成肽段對(duì)黑曲霉具有明顯的抗性，可能與抑制黑曲霉孢子囊的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。血藍(lán)蛋白的抑菌作用未對(duì)蝦等水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌、真菌病的防治提供新思路。

2.4 免疫活性及抗腫瘤活性

血藍(lán)蛋白還具有免疫活性和抗腫瘤活性，為抗菌肽的組成部分或前體物，在節(jié)肢和軟體等動(dòng)物的免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。郭睿等[22]報(bào)道，鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)可作為鯉魚類金魚免疫劑提高金魚自身的免疫活性。張晗等[21]運(yùn)用超速離心、基因克隆、熒光定量PCR等技術(shù)對(duì)鮑的血藍(lán)蛋白進(jìn)行了全面的研究分析，獲得了血藍(lán)蛋白的基因序列，超微結(jié)構(gòu)等結(jié)果，掌握了鮑血藍(lán)蛋白的免疫功能和表達(dá)調(diào)控規(guī)律，為以血藍(lán)蛋白為基礎(chǔ)的貝類免疫和病害防治打下了基礎(chǔ)。Gesheva 等[23]報(bào)道海產(chǎn)腹足類動(dòng)物紅螺血藍(lán)蛋白是一種良好的免疫生物佐劑候選物。血藍(lán)蛋白的研究揭示了一些水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生理和免疫機(jī)制，這也為選育優(yōu)良水產(chǎn)養(yǎng)殖品種和對(duì)一些疾病的防治奠定了基礎(chǔ)。

血藍(lán)蛋白首次被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性是在1974年由Olsson等發(fā)現(xiàn)的匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)能夠用于對(duì)淺表性膀胱癌的治療。隨后，各國(guó)學(xué)者進(jìn)一步進(jìn)行研究。曹勁松等[24]以對(duì)蝦血藍(lán)蛋白和人紅細(xì)胞為研究對(duì)象提出對(duì)蝦血藍(lán)蛋白與紅細(xì)胞可能通過硫氧還蛋白過氧化物酶實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗癌效果。陳傳道等[25]認(rèn)為血藍(lán)蛋白的抗腫瘤機(jī)制為血藍(lán)蛋白以某種方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部后，通過產(chǎn)生活性氧或醌類物質(zhì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞程序性凋亡或細(xì)胞自噬凋亡機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。鄭莉媛等[26]報(bào)道，凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白能夠通過線粒體的途徑對(duì)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生作用。

2.5 凝集活性

李長(zhǎng)平等(2017)研究發(fā)現(xiàn)[20]，凡納濱對(duì)蝦的血藍(lán)蛋白在胰蛋白酶的作用下能夠產(chǎn)生7條分子量大小在6～70kD的多肽分子，這幾種多肽分子混合后對(duì)副溶血弧菌具有顯著的凝集活性，比未分解的血藍(lán)蛋白凝集活性高出4～16倍。張澤惠等[27]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦、鋸緣青蟹血藍(lán)蛋白對(duì)副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、河弧菌(Vibrio fluvialis)、哈維氏弧菌(Vibrio har v eyi)、嗜水氣單胞菌(Aeromona hydrophila)、金黃色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)和大腸桿菌 K12(Escherichia coli K12)等7種細(xì)菌具有凝集活性，凝集活性大小分別為0.27～1.08 mg/L和7.5～30 mg/mL。

2.6 酚氧化酶活性

血藍(lán)蛋白還具有酚氧化酶活性，最早于1998年由Decker發(fā)現(xiàn)。Guo 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，羅曼蝸牛、烏賊和釘螺等軟體動(dòng)物血藍(lán)蛋白經(jīng)α-糜蛋白酶的作用后可表現(xiàn)出O-雙酚氧化酶活性。Perdomo 等[29，30]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和 SDS 處理的眼斑龍蝦血藍(lán)蛋白也表現(xiàn)出酚氧化酶活性。Kim 等[31]研究表明，北海道毛蟹體內(nèi)血藍(lán)蛋白在低溫的條件下(2.4℃～3.4℃)，經(jīng) SDS、脂多糖、磷壁酸等誘導(dǎo)也具有酚氧化酶活性。Coates 等[32]發(fā)現(xiàn)美洲鱟(Limulus polyphemus)體內(nèi)的磷脂酰絲氨酸在體內(nèi)同樣可激活血藍(lán)蛋白表現(xiàn)為酚氧化酶活性。Fujieda等[33]發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血藍(lán)蛋白5個(gè)單體均具有微弱的單酚氧化酶活性，且加入3M尿素后，其催化活性還可顯著提高。Dolashki等[34]發(fā)現(xiàn)軟體動(dòng)物脈螺(Rapana venosa)血藍(lán)蛋白功能亞基RvH1-a經(jīng)SDS、胰蛋白酶以及尿素等處理后，可發(fā)揮一定的雙酚氧化酶活性。

3 結(jié)語

血藍(lán)蛋白作為節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物血淋巴中的重要蛋白，在免疫、抗病毒、攜氧等方面具有重要作用。近年來對(duì)血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了較為深入的研究，但對(duì)于血藍(lán)蛋白在發(fā)揮免疫學(xué)功能的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑、功能多樣性的分子機(jī)制及基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機(jī)制等方面仍有待探索。有關(guān)血藍(lán)蛋白的研究，對(duì)血藍(lán)蛋白在生物信息傳導(dǎo)、生物藥開發(fā)、免疫抗體反應(yīng)、免疫佐劑研制以及選育抗逆優(yōu)良水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物品種和水產(chǎn)養(yǎng)殖中病害檢測(cè)與防治等具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。