鄧起秀

（欽州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西欽州，535000）

病理過程中生物標志物是由多種因素所致一類活動物質，以基因、組織變化進而由細胞合成表達，在體液、患者細胞組織中發(fā)生異常變化，對臨床診斷及治療復雜疾病具有重要意義。隨著我國分子生物學技術不斷發(fā)展，越來越多疾病相關生物標志物被發(fā)展及應用，包括DNA、RNA、蛋白質等，而醫(yī)學診斷中最為常見為蛋白質生物標志物，其中最為嚴重檢測載體為血清等體液樣本[1-2]。近些年來，酶聯(lián)免疫吸附試驗等酶免疫分析方法基礎上，液相懸浮芯片、微流控ELISA 等方式相繼出現(xiàn)，基于流式細胞術的生物標志物測定方法應用可提高檢測效率、信號靈敏度，開創(chuàng)熒光標記免疫分析、電化學發(fā)光免疫分析新時代[3]。文章就血清蛋白生物標志物免疫學測定技術研究進展如下分析，現(xiàn)報道如下。

1.免疫放射分析法

1968年，Mlies 和Hales 提出的免疫放射分析法（immunoradiometriec assay，IRmA）是在放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）基礎上建立的一種放射性同位素免疫標記測定技術。免疫分析法基于抗原抗體特異及可逆結合反應，采取標記物標記抗體，并放大檢測信號，對物質定性及定量檢測方法。免疫分析法核心內(nèi)容為抗原抗體特異性結合，因此，獲取免疫原性抗原、高特異性抗體成為免疫分析法建立前提及關鍵。其特點為制備放射性比活度高及穩(wěn)定性良好[4]。研究提示[5]，其檢測最低限度為0.4U/ml，適用于分析不易得到標記抗原、標記后易失活的生物活性物質。但上述檢測方式應用中，其濃度范圍偏窄，放射性材料會損傷操作人員及環(huán)境，而實際應用過程中條件受限，被后續(xù)發(fā)展酶免疫分析所替代。

2.酶免疫化學發(fā)光檢測法

2.1 ELISAELISA 作為目前常見免疫分析技術，對其基礎分析為抗原、抗體固相化及抗原、抗體酶標記?？乖贵w結合特異性、酶反應高效性有機結合可放大檢測信號，顯著提升敏感度，高效性、高靈敏度及特異性好，操作簡便等優(yōu)點[6]。對抗原、抗體結合方式下并設計出多種檢測方法，如間接法、雙抗體夾心法及抗原競爭法，被廣泛用于小分子抗原及半抗原檢測中，而目前常見一類方式為雙抗體夾心法。ELISA 應用過程中，其技術成熟、穩(wěn)定，實際操作靈活簡便，被廣泛用于血清蛋白標志物研究中。研究指出[7]，凝血因子XIII 四聚體特性建立快速夾心ELISA 檢測法，稀釋血液中添加人生物素化單克隆捕獲抗體、過氧化物酶標記單克隆標記抗體，對過氧化物酶活性測定，從而獲得鏈霉親和素包被微板上的復合物的數(shù)量。研究指出[8]，對ELISA、高效液相色譜法對血清中部隊曾二甲基精氨酸效能對比得出，其中高效液相色譜法靈敏度更高，對其結果分析指出，ELISA 應用過程中，靈敏度存在一定不足之處。

2.2 抗體蛋白芯片檢測技術抗體蛋白芯片操作是將多種高密度抗體固定在玻片、其他載體上，樣本經(jīng)芯片表面與待測抗原結合，并定量分析樣本中目標抗原。依據(jù)檢測方式分為直接標記抗體芯片法，捕獲抗體預先固定在芯片載體，應用生物素標記待測樣品，樣品與芯片反應后，并添加酶促化學發(fā)光底物并檢測[9]。而雙抗夾心法抗體芯片原理分析上，與ELISA 相似，但整體特異性、敏感性偏高，被用于目標分子定量檢測，抗體對之間存在相互影響，為此單次檢測目標分子數(shù)量受限。研究指出[10]，對系統(tǒng)性紅斑狼瘡血清樣本采取蛋白抗體芯片檢測系統(tǒng)篩查，對其結果分析指出，與ELISA 獲得結果一致。上述研究得出，蛋白抗體芯片檢測被用于疾病血清生物標記物中篩選、驗證具有顯著成效。但操作中，儀器昂貴，試驗成本高，難以普及及應用。

3.熒光免疫檢測技術

3.1 單分子免疫檢測單分子免疫檢測能將免疫復合物限制在足夠小的體積內(nèi)，并對產(chǎn)生信號絕對技術，歸屬為一種“數(shù)字化”免疫檢測技術[11]。目前單分子免疫檢測模式歸為以下兩類：原位檢測、隨機分配檢測。原位檢測是指在提前設定固定區(qū)域內(nèi)完成免疫復合物形成及檢測，高敏感型的檢測設備讀取信號，基于電傳感器、超高分辨率近場掃描顯微鏡及等離子納米孔的檢測方式，但操作中對儀器要求較高，信號極易受到干擾，對操作者整體要求較高。單分子免疫檢測被用于神經(jīng)性疾病、腫瘤及感染性疾病相關標志物檢測，因具備較高靈敏度特點，被研究者用于痕量標志物檢測價值及尋找更易獲得標本類型，如唾液、尿液等。但單分子免疫檢測對標志物檢測價值準確評價中，無需擔心因靈敏度不足所致假陽性[12]。同時，單分子免疫檢測與核酸檢測等同的靈敏度也可成為血液蛋白組學檢測提供有效手段。研究指出[13]，采取夾心免疫分析、單分子免疫檢測技術對低濃度樣品化血漿中的腎損傷分子-1 檢測，結果提示，兩種檢測技術下血清腎損傷分子-1 均上升，可預測腎損傷情況及程度。該類技術優(yōu)勢為超高檢測靈敏度，但應用過程中僅能檢測一種因子，整體效率偏低。

3.2 多重熒光免疫分析法傳統(tǒng)ELISA 等單重分析技術操作中，所需血清樣本量維持在50～100ul，其檢測樣本數(shù)受限，期間連續(xù)對10 個血清生物標記物檢測，則需要多達500～1000ul 樣本量、檢測時間，多數(shù)情況下，臨床樣本數(shù)量受限，而ELISA 試驗操作中對樣本量、檢測通量要求較高。多重熒光免疫分析涵蓋以下兩類：基于微球的液相懸浮芯片分析方法，包括Luminex液相懸浮芯片檢測、微流控ELISA 法和流式細胞微球陣列檢測法[14]。基于固相芯片多重檢測，不同熒光標記捕獲抗體固定故在固相支持物上，呈現(xiàn)點陣排列互補干擾，代表技術包括Meso Scale Discovery（MSD）微陣列技術。液相懸浮芯片優(yōu)勢為定性、定量測定少量樣本中多種生物標志物，樣本量及時間成本節(jié)省。同時，測試微球在液相中產(chǎn)生免疫反應，對固相芯片在大分子檢測表面張力、空間效應等反應動力學影響較小，樣品檢測可寵幸高達90%以上，線性范圍達到0.2～32000pg/ml。微流控ELISA 法將抗體包在微流體玻璃反應管，血清經(jīng)流經(jīng)微流體玻璃反應管目標分子被特異性抗體捕獲，與反應板上預裝的生物素標記二抗雜交，在熒光標記酶聯(lián)親和素顯色[15]。流式細胞微球陣列檢測法則是將流式細胞術、熒光微球結合多重蛋白標志物測定量檢測方法。被用于血清、細胞培養(yǎng)上清液等樣本中生物標志物篩選及定量。僅需少量樣本并實現(xiàn)多參數(shù)檢驗，避免ELISA 反應中酶聯(lián)放大所致假陽性結果。

4.小結

蛋白生物標志物篩選及定量分析，作為醫(yī)藥研究領域中重要研究課題，近些年來隨著生物技術不斷發(fā)展，而有關疾病相關生物標志物數(shù)量增長，對機體健康造成較大影響。為發(fā)揮血清蛋白生物標志物應用價值，如何選擇特異性高、靈敏度高及高通量檢測方法尤為重要。目前常見為ELISA、熒光免疫檢測技術等，不同檢測方法具體應用需依據(jù)研究者自己樣本消耗量、生物標志物種類及豐富高低的動態(tài)范圍綜合比較和驗證，選擇最佳合適方式。但目前實際應用期間，尚未統(tǒng)一規(guī)范檢測標準，在抗原的均一性、抗體穩(wěn)定性及檢測方法重復性、靈敏度等方面研究，仍是后期學者研究目標。