歐 銅,張 兵,張秀明
(深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 深圳 518001)
新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)疫情的全球大流行危害嚴(yán)重。新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)在COVID-19確診、病毒傳播鏈阻斷及疫情防控中發(fā)揮著重要作用。新型冠狀病毒基因組破譯后,基于病毒特異性基因序列研發(fā)的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)核酸檢測(cè)技術(shù),為COVID-19的確診提供了靈敏度高、特異性好的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。機(jī)體感染新型冠狀病毒后會(huì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng),在血清中先后出現(xiàn)IgM、IgG抗體。血清學(xué)抗體檢測(cè)聯(lián)合核酸檢測(cè)可減少漏診,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。人群普遍接種新型冠狀病毒疫苗后會(huì)產(chǎn)生“假陽性”,給血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果的解讀帶來了挑戰(zhàn),但通過檢測(cè)血清中和抗體,有助于評(píng)估疫苗接種后的群體免疫力。新型冠狀病毒抗原檢測(cè)主要靶向病毒自身蛋白,雖靈敏度低于核酸檢測(cè),但操作便捷,可快速獲得檢測(cè)結(jié)果,且不受疫苗接種影響。為了高效應(yīng)對(duì)大規(guī)模核酸檢測(cè),國家衛(wèi)生健康委先后出臺(tái)了“混檢”與不同規(guī)格“混采”的技術(shù)指引與規(guī)范[1-3]。隨著疫情與常態(tài)化防控的持續(xù),實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)也在更新迭代,對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)劣和應(yīng)用場景進(jìn)行再認(rèn)識(shí)與思考,有利于疫情的科學(xué)防控。本文在新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作實(shí)踐的基礎(chǔ)上,結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研,對(duì)5個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問題進(jìn)行分析,并提出應(yīng)用建議。
快速篩查對(duì)控制新型冠狀病毒傳播至關(guān)重要。考慮到核酸檢測(cè)能力、效率和衛(wèi)生資源壓力,國家衛(wèi)生健康委分別于2020年7月21日、8月17日、2022年1月15日發(fā)布了《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測(cè)技術(shù)指引》[1]《新冠病毒核酸10合1混采檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》[2]和《關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸20合1混采檢測(cè)技術(shù)規(guī)范的通知》[3],推薦使用稀釋混合檢測(cè)、10合1混采和20合1混采檢測(cè),以加快新型冠狀病毒篩查效率,及時(shí)阻斷傳播鏈,節(jié)約社會(huì)資源。
實(shí)驗(yàn)室稀釋混合檢測(cè)也稱為單采混檢。混采目前比較常用的是5合1、10合1或20合1的方式。任何現(xiàn)有的匯集檢測(cè)策略,無論是匯集樣本還是提取核酸,都不可避免地要稀釋病毒。一般來說,匯集樣本的數(shù)量越多,產(chǎn)生假陰性的可能性就越大。假設(shè)擴(kuò)增效率為100%,按循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)(標(biāo)本熒光強(qiáng)度達(dá)到檢測(cè)限需要擴(kuò)增的循環(huán)數(shù))大小與原始模板量之間的關(guān)系:濃度2倍稀釋,Ct值升高1.00;濃度4倍稀釋,Ct值升高2.00;濃度10倍稀釋,Ct值升高3.32。目前,新型冠狀病毒核酸檢測(cè)單人單管病毒保存液為3 mL,5合1混采管病毒保存液為3 mL,不影響病毒濃度;10合1混采管病毒保存液為6 mL,病毒濃度是單人單管的1/2,弱陽性標(biāo)本有可能被漏檢;20合1混采病毒管保存液為12 mL,與單人單管相比病毒被4倍稀釋,弱陽性標(biāo)本更有可能被漏檢。如果混采結(jié)果為陽性,則需對(duì)混采的幾個(gè)受試者暫時(shí)隔離,并重新采集單管拭子進(jìn)行復(fù)核。存在的問題是,需要對(duì)所有人員重新單采檢測(cè),使流調(diào)難度大大增加,而且所有樣本都要重新提取核酸重新檢測(cè),有可能貽誤時(shí)機(jī),造成病毒在人群中的傳播。雖然2合1混檢與10合1混采的靈敏度相同,4合1混檢與20合1混采的靈敏度相同,但混檢陽性時(shí),實(shí)驗(yàn)室只需要對(duì)原樣本單獨(dú)提取核酸和檢測(cè)即可,可在短時(shí)間內(nèi)鎖定陽性樣本,極大地方便了后續(xù)的流調(diào)工作,防控效率提高,但對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)來講,檢測(cè)成本會(huì)相應(yīng)增加。
羅穎等[4]提出了一種聯(lián)合混采與混檢的混合樣本池策略,能夠在單一實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)孔中準(zhǔn)確地篩查超過90個(gè)樣本,同時(shí)保持極低的假陰性率,適用于COVID-19發(fā)病率低地區(qū)的大規(guī)模篩查和監(jiān)測(cè)。董宏杰等[5]在新型冠狀病毒混合檢測(cè)中,采用注射器純化柱法從全部樣本的混合保存液中提取核酸,稀釋混樣檢測(cè)時(shí),可將混合人數(shù)上限由20提高到50。
綜上所述,從流調(diào)效率來講,混檢的防控效果要優(yōu)于混采;從節(jié)省檢測(cè)成本的角度出發(fā),混采優(yōu)于混檢。不同品牌的檢測(cè)試劑盒性能有所不同,建議選擇靈敏度較高的逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑;目前的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒的陽性判讀Ct值一般為40,整個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為45,探索Ct值在38~40的樣本,混采或混檢后,能否在40~45個(gè)循環(huán)內(nèi)形成S型擴(kuò)增曲線具有重要的研判價(jià)值。無論是混采,還是混檢,都可提高總體檢測(cè)效率,有助于疫情的防控。但應(yīng)注意的是,隨著社區(qū)病例數(shù)的不斷增多,單個(gè)樣本的檢測(cè)需求量也會(huì)增大,而混合檢測(cè)并不能代替這種需求。
核酸檢測(cè)依賴于寡核苷酸(引物和探針)與病毒基因組中各自靶序列之間的特異性雜交,通過熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的檢測(cè)?;谠缙诖罅餍袀鞑サ男滦凸跔畈《局晷蛄?,引物和探針靶向的RNA序列可以位于編碼結(jié)構(gòu)蛋白[包膜(envelope,E)蛋白、刺突(spike,S)蛋白、核衣殼(nucleocapsid,N)蛋白]的基因中,或者位于開放閱讀框(ORF1ab)中。隨著疫情的全球大流行,已出現(xiàn)了不少傳播力、致病力和免疫原性各異的病毒變異株[6]。大多學(xué)者認(rèn)為,現(xiàn)有的核酸檢測(cè)試劑盒大部分都是針對(duì)新型冠狀病毒2個(gè)及以上基因設(shè)計(jì)多組特異性引物與探針,只要其中1組引物與探針檢測(cè)成功即判定為可疑陽性,新出現(xiàn)的變異恰好都在各組引物上的概率很低,因此核酸檢測(cè)試劑盒受病毒變異的影響不大[7]。針對(duì)我國8 488家實(shí)驗(yàn)室開展的新型冠狀病毒Delta變異株核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,同濃度水平的Delta變異株和非變異株樣本符合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示Delta變異株未影響我國現(xiàn)有核酸檢測(cè)試劑的適用性[8]。有學(xué)者使用瑞士羅氏公司核酸試劑檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),雖然8例26340C>U突變的樣本E基因全部漏檢,但ORF1ab基因均被檢出[9]。也有學(xué)者認(rèn)為,ORF1ab、S、E和N靶基因的突變可能會(huì)干擾逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)的特異性,但大多是基于生物信息學(xué)的分析,不能真實(shí)反映臨床應(yīng)用中的診斷性能[10-12]。因此,在資源有限時(shí),為了避免新型冠狀病毒變異株的某一突變位點(diǎn)引起靶標(biāo)基因檢測(cè)假陰性結(jié)果,建議實(shí)驗(yàn)室使用針對(duì)新型冠狀病毒2個(gè)及以上獨(dú)立的基因區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)的試劑。同時(shí),應(yīng)及時(shí)使用不同品牌的核酸檢測(cè)試劑對(duì)單靶標(biāo)陽性的核酸標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核[13]。
內(nèi)標(biāo)為同一反應(yīng)體系中與靶序列共同檢測(cè)的一段非靶序列分子,用于監(jiān)控檢測(cè)流程。內(nèi)標(biāo)有2種形式,一種是利用天然樣品中含有的基因序列(內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)),另一種是在檢測(cè)過程中人工添加的外源性序列(外源性內(nèi)標(biāo))。
內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)通常選擇不同個(gè)體間序列保守且在各組織與細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的基因,如GAPDH、β-actin、18sRNA等管家基因。內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)與靶基因處理程序完全相同,具有監(jiān)控采樣、運(yùn)輸、核酸提取與擴(kuò)增全流程優(yōu)勢(shì),但人體細(xì)胞或組織與病毒顆粒存在一定的基因提取效率差異,且環(huán)境樣本中因無人體組織或細(xì)胞,無法對(duì)內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)進(jìn)行平行檢測(cè)。外源性內(nèi)標(biāo)根據(jù)非靶序列存在的形式常分為2種:一種是直接添加不會(huì)干擾靶序列擴(kuò)增的人工合成非靶序列在擴(kuò)增反應(yīng)體系中與模板一起擴(kuò)增,監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程;另一種是人工合成的假病毒,如MS2噬菌體,在核酸提取前被加入到提取體系中,假病毒包被的非靶序列內(nèi)參參與核酸提取與擴(kuò)增,監(jiān)控檢測(cè)過程。外源性內(nèi)標(biāo)無法監(jiān)控采樣與運(yùn)輸過程,但因其與靶序列的存在形式相似,能更精細(xì)地監(jiān)測(cè)提取與擴(kuò)增過程,對(duì)環(huán)境樣本同樣有效。
目前的大規(guī)模篩查多采用5合1、10合1混采檢測(cè),部分地區(qū)已采用20合1混采檢測(cè),1管混采標(biāo)本,無論是5合1、10合1,還是20合1,只要其中1個(gè)樣本采樣合格,整管樣本利用內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)進(jìn)行采樣-檢測(cè)全流程監(jiān)測(cè),其檢測(cè)結(jié)果即為合格,這使內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)的監(jiān)控采樣至擴(kuò)增全流程的優(yōu)勢(shì)無法發(fā)揮。內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)只針對(duì)單采樣本,如隔離點(diǎn)、封控區(qū)的重點(diǎn)人群采樣,才能體現(xiàn)出全流程監(jiān)控的優(yōu)勢(shì)。雖然在大規(guī)模核酸檢測(cè)過程中,因混采技術(shù)的使用,內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)無法有效監(jiān)測(cè)采樣過程,但可節(jié)省添加內(nèi)標(biāo)的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié),在大批量樣本檢測(cè)過程中,可減少實(shí)驗(yàn)室工作量,快速出具報(bào)告。外源性內(nèi)標(biāo)在進(jìn)行環(huán)境樣本檢測(cè)方面具有一定優(yōu)勢(shì),因環(huán)境樣本中不存在內(nèi)源性內(nèi)標(biāo),對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)試劑無法檢測(cè)到內(nèi)標(biāo),即無法監(jiān)測(cè)提取與擴(kuò)增過程,而在每份樣品中加入等量的外源性內(nèi)標(biāo)進(jìn)行提取與擴(kuò)增,因內(nèi)標(biāo)添加量穩(wěn)定,擴(kuò)增曲線趨于一致,可監(jiān)控每個(gè)樣本提取與擴(kuò)增情況。
綜上所述,外源性和內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)各有優(yōu)劣,目前尚無文件明確哪種更好,獲得我國國家藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒既有采用內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)的方式,也有采用外源性內(nèi)標(biāo)的方式。因此,在檢測(cè)中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的不同需求與應(yīng)用場景靈活選擇,綜合應(yīng)用。
隨著具有超強(qiáng)傳播能力的奧密克戎(Omicron)毒株的出現(xiàn),國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制綜合組及時(shí)優(yōu)化了疫情防控策略,印發(fā)了《新型冠狀病毒抗原檢測(cè)應(yīng)用方案(試行)》[13],開始推進(jìn)“抗原篩查、核酸診斷”的監(jiān)測(cè)模式”。同時(shí),國家衛(wèi)生健康委和國家中醫(yī)藥管理局也發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》[14],將抗原檢測(cè)作為核酸檢測(cè)的補(bǔ)充。
抗原檢測(cè)試劑的應(yīng)用依賴于診斷性能、COVID-19流行率、感染癥狀及標(biāo)本質(zhì)量等多種因素。世界衛(wèi)生組織在針對(duì)新型冠狀病毒感染診斷的抗原檢測(cè)指南中指出,基于新型冠狀病毒自檢快速抗原檢測(cè)的使用,其臨床性能與專業(yè)快速抗原檢測(cè)相當(dāng),與核酸檢測(cè)相比,快速抗原檢測(cè)應(yīng)滿足最低性能要求,即敏感性≥80%,特異性≥97%[15]。截至2022年4月12日,我國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的抗原檢測(cè)試劑盒已增至34個(gè)。德國保羅埃利希研究所對(duì)歐盟市售的122種抗原檢測(cè)試劑進(jìn)行了性能評(píng)估,結(jié)果顯示,以標(biāo)本PCR檢測(cè)結(jié)果(Ct值)≤25,敏感性>75%作為產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn),不同品牌試劑的敏感性差異大,其中有96種試劑滿足要求,26種試劑敏感性為0%~58.8%,20種試劑檢測(cè)Ct值≤25的標(biāo)本時(shí),敏感性可達(dá)100%,Ct值為25~30時(shí),敏感性>75%[16]。目前流行的新型冠狀病毒感染以無癥狀為主。有研究結(jié)果顯示,抗原檢測(cè)試劑篩查無癥狀感染者的敏感性為28.8%~51.5%,特異性89.2%~99.5%,以1%感染流行率推測(cè)抗原試劑陰性預(yù)測(cè)值>99%,陽性預(yù)測(cè)值<50%[17]。提示在我國新型冠狀病毒感染流行率低的區(qū)域不適合進(jìn)行大規(guī)??乖Y查。抗原檢測(cè)對(duì)傳染期的病毒具有較高敏感性,感染者一般在感染第3~7天病毒載量最高,因此抗原檢測(cè)更適用于處于感染到發(fā)病1周內(nèi)的人群的篩查,有利于“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療”的防控需求,可以實(shí)現(xiàn)早期分級(jí)管理。由于抗原檢測(cè)在15~30 min即可出結(jié)果,即采即檢,與核酸檢測(cè)相比,可大大提高檢測(cè)效率,且方便、快捷、成本低,普通民眾可居家檢測(cè),便于分流有新型冠狀病毒核酸檢測(cè)需求的人群,有效緩解核酸檢測(cè)壓力。作為自測(cè)試劑,采樣的質(zhì)量是抗原檢測(cè)關(guān)鍵的影響因素,但隨著抗原試劑的推廣使用,大量視頻宣傳等均對(duì)采樣操作進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)示范,有助于保障居民居家隔離抗原試劑檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
結(jié)合應(yīng)用方案、國內(nèi)外疫情防控政策及抗原應(yīng)用條件,新型冠狀病毒抗原檢測(cè)可考慮應(yīng)用的場景包括:(1)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)發(fā)熱門診的快速分診,尤其適用于伴有呼吸道、發(fā)熱等癥狀且出現(xiàn)癥狀5 d以內(nèi)的人群;(2)存在聚集性暴發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)的場景,如集中在封閉或半封閉環(huán)境的人群,包括學(xué)校、療養(yǎng)院、游輪、監(jiān)獄、工作場所和宿舍;(3)重點(diǎn)場所的監(jiān)測(cè),如人流密集的機(jī)場、火車站、海關(guān)、定點(diǎn)隔離機(jī)構(gòu)等,采用抗原聯(lián)合核酸篩查定期監(jiān)測(cè),可前移篩查關(guān)口;(4)封控區(qū)、管控區(qū)、居家隔離人員等的篩查,可提高封控和管控社區(qū)的管理效率。新型冠狀病毒抗原檢測(cè)方法學(xué)包括熒光免疫層析、膠體金、乳膠法等,除手工檢測(cè)外,還有便攜式儀器檢測(cè)和自動(dòng)化檢測(cè)設(shè)備被相繼研發(fā)出來,可適用不同場景。因此,在常態(tài)化疫情防控中,抗原檢測(cè)有利于有癥狀或潛在感染高風(fēng)險(xiǎn)人群的快速篩查和分流。
抗體是指機(jī)體由于抗原的刺激而產(chǎn)生的具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。機(jī)體感染新型冠狀病毒后,先產(chǎn)生血清特異性抗體IgA,發(fā)病約1周后產(chǎn)生IgM抗體,最后出現(xiàn)IgG抗體,IgM抗體水平增高提示近期急性感染,IgG抗體水平增高提示既往感染[18]。在接種新型冠狀病毒疫苗后,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生“中和抗體”,中和抗體來源于IgM、IgG和IgA中的一部分,通過結(jié)合病毒表面S蛋白,阻斷其與細(xì)胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受體的結(jié)合,進(jìn)而阻止病毒侵入細(xì)胞[19]。
目前,國內(nèi)外已有多種新型冠狀病毒抗體檢測(cè)試劑獲批上市,包括總抗體、IgA、IgM、IgG和中和抗體檢測(cè)試劑。隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的深入和診療經(jīng)驗(yàn)的積累,為進(jìn)一步加強(qiáng)早診、早治方針的實(shí)施,《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》[14]明確規(guī)定:未接種新型冠狀病毒疫苗者新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體均為陽性,可作為疑似病例確診的證據(jù)之一。特異性抗體可作為COVID-19輔助診斷的指標(biāo),可聯(lián)合核酸檢測(cè)對(duì)疑似病例進(jìn)行分析[20-21],還可用于COVID-19患者的治療監(jiān)測(cè)[22-23]。
截至2022年4月11日,全球新型冠狀病毒疫苗的接種率為64%,我國接種率高達(dá)88%[24]。因此,隨著全球新型冠狀病毒疫苗接種的普及,中和抗體檢測(cè)可評(píng)估疫苗接種后的免疫效果,包括參與輔助疫苗開發(fā)、疫苗免疫效果評(píng)估、疫苗保護(hù)力閾值研究和疫苗持久性研究。TENBUSCH等[25]對(duì)接種不同類型新型冠狀病毒疫苗后的人群進(jìn)行了中和抗體的評(píng)估,發(fā)現(xiàn)異源接種加強(qiáng)針疫苗的效果更優(yōu)。TADA等[26]分析了基于mRNA和腺病毒載體疫苗產(chǎn)生抗體對(duì)變異假型新型冠狀病毒的中和能力,發(fā)現(xiàn)接種BNT162b2和mRNA-1273后產(chǎn)生的抗體對(duì)新型冠狀病毒多種變異株表現(xiàn)出適度的中和抗性,而接種Ad26.COV2.S后產(chǎn)生的抗體的中和滴度較低。DORIA-ROSE等[27]通過中和抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),對(duì)新型冠狀病毒疫苗接種效果的持久性進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)接種疫苗200 d后,中和抗體滴度仍較高。
綜上所述,在未接種新型冠狀病毒疫苗人群中,特異性IgG、IgM抗體陽性對(duì)核酸檢測(cè)陰性的COVID-19疑似病例的確診具有重要意義。在接種了新型冠狀病毒疫苗人群中,病毒中和抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)具有重要參考價(jià)值,有助于確定疫苗保護(hù)力閾值,且對(duì)中和抗體水平進(jìn)行更長時(shí)間的持續(xù)定量檢測(cè),還有助于評(píng)估是否需要加強(qiáng)免疫。
隨著疫情的持續(xù),核酸檢測(cè)、抗體檢測(cè)、抗原檢測(cè)這3種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)在新型冠狀病毒篩查與COVID-19診斷中相互結(jié)合,逐步完善,以適應(yīng)不同階段疫情防控的需求,為疫情防控提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。(1)核酸檢測(cè)敏感性和準(zhǔn)確性最高;(2)高滴度病毒載量條件下快速抗原檢測(cè)有助于提高診斷效率,在大流行時(shí)期或者潛在感染率較高的重點(diǎn)場所與封閉管控區(qū)域,抗原檢測(cè)可快速分流人群,降低聚集感染風(fēng)險(xiǎn);(3)無癥狀感染者主要來自密接或重點(diǎn)關(guān)注人群,為減少因采樣部位病毒載量不足導(dǎo)致的漏檢,聯(lián)合特異性IgM、IgG抗體檢測(cè)來動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)機(jī)體免疫反應(yīng)具有重要意義。COVID-19已在全球流行近3年,建立群體免疫屏障有助于早日結(jié)束疫情大流行,在與病毒賽跑的過程中,各種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的合理應(yīng)用是關(guān)鍵。