宋皓

（山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院，山西太原 030025）

阿爾茨海默病屬于常見神經(jīng)退行性的疾病，其臨床特征主要為漸進(jìn)性認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙、出現(xiàn)行為損害。有報(bào)道結(jié)果顯示，Aβ蛋白的沉積可誘導(dǎo)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并能參與體內(nèi)的免疫應(yīng)答，分泌大量炎性因子，例如白介素6、干擾素，從而影響神經(jīng)炎性的反應(yīng)，致使阿爾茨海默病發(fā)展[1]。目前，世界各國(guó)的醫(yī)療工作者和有關(guān)專家已就這種疾病的致病機(jī)理以及治療方法等進(jìn)行了研究，并取得了很多新的進(jìn)展。然而，由于大腦的復(fù)雜性，當(dāng)前還未找到一種理想的治療方法，盡管有100多種潛在治療阿爾茨海默癥的藥物參與了臨床試驗(yàn)，但最終保留下來(lái)的公認(rèn)安全、有效的治療藥物卻僅有三四種[2]。而嗎替麥考酚酯就是其中之一，它是一種免疫抑制劑，是一種前體藥物，其進(jìn)入人體之后水解成霉酚酸而產(chǎn)生免疫抑制作用。在細(xì)胞內(nèi)將受損細(xì)胞器降解的自噬行為為細(xì)胞的生存提供物質(zhì)及能量。有報(bào)道顯示，阿爾茨海默病特點(diǎn)之一為自噬活性的降低，相關(guān)研究明確，Beclin-1蛋白及LC3在自噬通路中分別發(fā)揮著誘導(dǎo)自噬的啟動(dòng)和促進(jìn)自噬小體成熟的作用[3]。Beclin-1與LC3兩種蛋白均在阿爾茨海默病的患者腦內(nèi)呈現(xiàn)低表達(dá)。本文主要通過(guò)SD雄性大鼠制作的阿爾茨海默病大鼠模型，研究分析嗎替麥考酚酯對(duì)其海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 藥物、實(shí)驗(yàn)器械

嗎替麥考酚酯（國(guó)藥準(zhǔn)字H20059282，0.5 g），重慶萊美藥業(yè)股份有限公司；多奈哌齊（國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H20030472，5 mg），江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

51600型大鼠的腦立體定位儀，上海玉研科學(xué)儀器有限公司；STELLARIS 5共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica公司；JS-2000凝膠成像儀，上海培清科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取質(zhì)量為（250±30）g的SD雄性大鼠，來(lái)源于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有選取的大鼠均在溫度（24±4）℃、濕度（39±9）%的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 制作模型方法、分組方法及用藥

（1）模型的制作。應(yīng)用戊巴比妥鈉腹腔的方法對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，在大鼠的腦立體定位儀上固定其頭部，切開皮膚，露出其顱骨，對(duì)前顱進(jìn)行定位，并在前顱后面1.5 mm、旁開0.8 mm的位置定位側(cè)腦室，顱骨鉆孔，骨窗的直徑大約為2 mm，通過(guò)微量注射器注射2 μL的Aβ25-35，緩慢進(jìn)針，保持4 mm的深度并回退1 mm，緩慢注射5min且需留針5 min，退針后縫合皮膚，用碘伏消毒[4]。1組于側(cè)腦室注射2 μL的生理鹽水，其他3組注射2μL的Aβ25-35，注射方式同前，存活下來(lái)的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（2）實(shí)驗(yàn)分組及用藥。實(shí)驗(yàn)分為1組、2組、3組、4組。1組（對(duì)照組）：每天注射0.9%的等量生理鹽水（無(wú)菌），40 d不間斷注射；2組（模型組）、3組（給藥組）以及4組（陽(yáng)性對(duì)照組）：每日注射一次標(biāo)準(zhǔn)為120 g/kg的D-半乳糖。其中，2組每天給予0.9%的等量生理鹽水（無(wú)菌），3組每天一次嗎替麥考酚酯，劑量為0.2 g/次，4組為多奈哌齊（陽(yáng)性對(duì)照）組。每組10只，所有大鼠在清醒之后給藥，均使用對(duì)應(yīng)藥物作灌胃處理，且持續(xù)給藥4周。

1.4 識(shí)別實(shí)驗(yàn)

用不透明的檢測(cè)箱對(duì)大鼠進(jìn)行3個(gè)階段（適應(yīng)、訓(xùn)練、檢測(cè)）訓(xùn)練[5]。適應(yīng)階段：檢測(cè)箱內(nèi)無(wú)任何物體，將大鼠放置箱內(nèi)活動(dòng)5 min，再將大鼠取出；訓(xùn)練階段：將2個(gè)相同物體放于檢測(cè)箱內(nèi)，并將大鼠背對(duì)物體放置，讓大鼠對(duì)2個(gè)物體熟悉，10 min后將大鼠取出；檢測(cè)階段：原檢測(cè)箱內(nèi)2個(gè)相同物體取出1個(gè)，并重新放置1個(gè)形狀不同新物體，將大鼠放置箱內(nèi)活動(dòng)5 min，記錄大鼠舔咬、蹭擦新物體的時(shí)間或者鼻子挨近新物體1 cm內(nèi)的范圍，即屬于大鼠對(duì)新、舊物體探索的時(shí)間。3個(gè)階段的訓(xùn)練均需間隔24 h，且每次、每只大鼠放置檢測(cè)箱之后，均用乙醇擦拭檢測(cè)箱及所有物體。用識(shí)別指數(shù)（DI）評(píng)價(jià)大鼠對(duì)不同物體探索的時(shí)間，按公式（1）計(jì)算。

式中：N為大鼠對(duì)新物體探索消耗的時(shí)間，s；F為大鼠對(duì)熟悉物體探索消耗的時(shí)間，s。

1.5 水迷宮實(shí)驗(yàn)

注入溫度為（23±3）℃清水于水迷宮桶內(nèi)，水面高過(guò)平臺(tái)，且高出2 cm，加入藍(lán)墨水。逃避潛伏期：等距離將水桶上緣分為4個(gè)點(diǎn)，大鼠面對(duì)池壁從任意1個(gè)點(diǎn)入水，游到平臺(tái)且站到平臺(tái)時(shí)間。每只大鼠每天記錄1次逃避潛伏期，連續(xù)記錄5 d，同時(shí)記錄5 d游泳距離，取平均值。第6天取消平臺(tái)，大鼠從任意1個(gè)點(diǎn)入水，記錄大鼠1 min之內(nèi)到原平臺(tái)次數(shù)，檢測(cè)大鼠記憶[6]。

1.6 HE染色

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，將每組大鼠深度麻醉，開胸暴露心臟，從左心室刺入主動(dòng)脈，先快速灌注磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，4 ℃），再灌注4%多聚甲醛溶液（溶解于PBS，4 ℃）固定。斷頭取腦，將腦浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定保存（4 ℃），用石蠟包埋海馬，制成5 μm厚度切片，后經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察拍照。從每個(gè)大腦中選擇4～5片進(jìn)行分析，每個(gè)切片同一個(gè)平面范圍內(nèi)腦組織神經(jīng)元受損情況重復(fù)分析兩次[7]。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)提取自海馬區(qū)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)制膠、電泳、封閉、一抗孵育過(guò)夜，LC3及Beclin-1以及內(nèi)參β-actin一抗?jié)舛雀鶕?jù)說(shuō)明書稀釋。二抗孵育1 h之后，將膜放在凝膠成像儀，加發(fā)光劑，將顯影曝光，以Image J分析Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組內(nèi)均數(shù)用one-way ANOVA，組間均數(shù)用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組識(shí)別指數(shù)、穿環(huán)次數(shù)、游泳距離、潛伏期的對(duì)比

由表1可知，與第1組相比較，第2組識(shí)別指數(shù)及穿環(huán)次數(shù)均顯著下降，潛伏期及游泳距離顯著增加，且P均＜0.05；與第2組相比較，第3組、第4組識(shí)別指數(shù)及穿環(huán)次數(shù)均顯著增加，潛伏期及游泳距離顯著下降，且P均＜0.05。

表1 各組識(shí)別實(shí)驗(yàn)指數(shù)、穿環(huán)次數(shù)、游泳距離、潛伏期的對(duì)比（±s）

表1 各組識(shí)別實(shí)驗(yàn)指數(shù)、穿環(huán)次數(shù)、游泳距離、潛伏期的對(duì)比（±s）

注：“*”表示與第1組相比，P＜0.05；“#”表示與第2組相比，P＜0.05。下同。

組別 識(shí)別指數(shù)/%穿環(huán)次數(shù)/次游泳距離/c m 潛伏期/s第1組（n=1 0） 5 3.2 2±5.4 9 1 1.2 3±3.5 2 2 3.3 7±5.6 8 3 4.3 3±5.4 2第2組（n=1 0） 1 3.5 4±9.0 2*4.6 8±1.6 7*7 3.6 5±9.6 7*8 7.6 5±6.3 2*第3組（n=1 0） 3 1.6 5±5.6 8#7.9 8±1.2 9#5 3.4 2±5.4 4#6 4.5 2±4.5 2#第4組（n=1 0） 3 3.9 6±6.9 8#8.0 3±1.7 4#5 0.6 8±5.6 4#4 4.6 8±3.7 1#

2.2 各組大鼠凋亡小腦神經(jīng)細(xì)胞的情況

如圖1所示，本文對(duì)各組動(dòng)物海馬區(qū)進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)與第1組相比，第2組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞帶排列紊亂、稀疏，出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、可見核固縮或溶解、細(xì)胞空泡以及胞體不規(guī)則等形態(tài)學(xué)改變。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示，與第1組相比，第2組大鼠CA1區(qū)椎體細(xì)胞凋亡增多，神經(jīng)元密度顯著降低。與第2組相比，第3組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量顯著增多；第4組神經(jīng)元細(xì)胞排列更加整齊，凋亡的細(xì)胞與3組無(wú)明顯差異。因此可以得出嗎替麥考酚酯能夠有效阻止神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

圖1 各組大鼠海馬錐體神經(jīng)元HE染色（Bar=50 μm）

2.3 各組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達(dá)

由表2可知，與第1組相比較，第2組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與第2組相比較，第3組、第4組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達(dá)顯著上升（P＜0.05）。表明嗎替麥考酚酯能夠有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性，并且其活性與Beclin-1與LC3的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[8]。

表2 各組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達(dá)（±s）

表2 各組大鼠海馬自噬蛋白Beclin-1與LC3的表達(dá)（±s）

組別 Beclin-1 LC3第1組（n=10） 0.88±0.12 0.69±0.11第2組（n=10） 0.21±0.04* 0.31±0.08*第3組（n=10） 0.66±0.08# 0.64±0.07#第4組（n=10） 0.73±0.11# 0.69±0.12#

3 討論

阿爾茨海默病神經(jīng)病理的特點(diǎn)之一為大腦出現(xiàn)顯著Aβ蛋白沉積，并且Aβ蛋白的積聚程度和阿爾茨海默病病情程度相關(guān)。當(dāng)阿爾茨海默病的患者或者阿爾茨海默病的動(dòng)物模型出現(xiàn)腦組織中Beclin蛋白中Beclin-1基因下降，Beclin-1蛋白表達(dá)出現(xiàn)缺失，導(dǎo)致自噬水平降低，自噬體減少，Aβ蛋白生成但未被降解，出現(xiàn)異常的沉積，最終會(huì)形成阿爾茨海默病。嗎替麥考酚酯屬于免疫抑制劑中最為典型的藥物，使用嗎替麥考酚酯能夠有效掌控阿爾茨海默病的病情發(fā)展[9]。自噬屬于存在真核細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞代謝的現(xiàn)象，可保持細(xì)胞內(nèi)代謝環(huán)境的穩(wěn)定，但自噬損傷或者自噬過(guò)度對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。自噬具有能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、代謝、生長(zhǎng)、死亡及神經(jīng)保護(hù)性、退行性作用的重要生物學(xué)功能[9]。LC3是自噬泡內(nèi)膜中的自噬調(diào)節(jié)蛋白，細(xì)胞自噬時(shí)LC3被加工并溶于細(xì)胞質(zhì)，LC3-Ⅰ型與自噬泡膜的磷脂酰乙醇胺合并形成LC3-Ⅱ，發(fā)揮調(diào)節(jié)的功能，所以LC3蛋白的表達(dá)能夠直觀顯示細(xì)胞的自噬活性。

本研究運(yùn)用識(shí)別實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。研究實(shí)驗(yàn)中，嗎替麥考酚酯能夠緩解神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，可提高自噬的活性，能夠有效降低小膠質(zhì)細(xì)胞活性，其機(jī)制與強(qiáng)化自噬水平及增強(qiáng)Beclin-1與LC3的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，嗎替麥考酚酯能夠有效改善阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知的能力，對(duì)于治療阿爾茨海默病有較好的療效。