曾宸， 蔡文靜， 葉甜甜*， 馮鈺锜

(武漢大學化學與分子科學學院，湖北武漢 430072)

隨著工業(yè)化進程的加快，重金屬污染問題日益嚴重。鎘是目前毒性最大、分布最廣的重金屬污染物之一[1]。鎘是植物生長非必需金屬元素，它通過阻礙植物水分和養(yǎng)分的吸收引起一系列代謝紊亂，如光合強度下降和酶活性的改變，蛋白質、糖和葉綠體合成受阻，使植物葉片萎黃，植株矮化，最終導致作物品質下降和產量減少，甚至死亡[2 - 4]。此外，重金屬鎘易被植物吸收并在可食用部分大量富集，從而進入食物鏈，嚴重影響人體的健康[3,5]。羧基化合物作為生物體內重要的小分子化合物，不僅以底物或者產物的形式直接參與中心碳代謝，而且也是脂類、蛋白質代謝路徑中重要的中間代謝物。此外，羧基化合物與植物的生長發(fā)育和脅迫應答等生理過程密切相關[ 6- 8]。當植物受到一定量的鎘脅迫后，會引起一系列羧基代謝物的含量變化來應對鎘脅迫[3,9,10]。例如，在鎘脅迫下，水稻會首先通過提高三羧酸循環(huán)中的部分前體和相關代謝產物的含量來抵御毒害[3,11]。另外，Zhang等[12]報道了鎘脅迫會促進有機酸的合成，而有機酸可與Cd2+發(fā)生螯合作用，從而抵御Cd2+的毒害。由此可見，羧基化合物在植物響應鎘脅迫中發(fā)揮了至關重要的作用[13 - 15]。因此，建立高靈敏度、高覆蓋度、高準確性的羧基化合物分析方法，將有助于了解植物對鎘脅迫的響應機理，從而減輕鎘脅迫造成的危害。

目前，在植物中檢測到的羧基化合物數量十分有限。Navarro-Reig等[15]用高效液相色譜-質譜檢測植物體內的化合物，發(fā)現在鎘脅迫條件下，水稻中的74個代謝物含量發(fā)生顯著變化，其中包括氨基酸、有機酸等22個羧基化合物。Sch?fer等[14]建立了固相萃取結合超高效液相色譜-串聯質譜法，實現了對100多種初級代謝物、次級代謝物，以及植物激素的高通量定量分析，其中僅包含60多種羧基化合物[14]。然而，這些方法都是在負離子模式下對羧基代謝物進行檢測，檢測靈敏度通常較低。因此，高靈敏度方法的開發(fā)將有助于植物中低豐度羧基化合物的發(fā)現和鑒定，從而豐富植物中羧基化合物的種類。

為了全面研究水稻中羧基化合物的組成，本文建立了基于穩(wěn)定同位素標記技術的羧基化合物的超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)全分析方法，并對鎘脅迫下水稻根部和地上部分的含羧基化合物進行了定性和相對定量研究。利用該方法在水稻樣品中一共發(fā)現了1 444個可能的含羧基化合物，其中648個化合物可以被定性(包括72個標準品確認，13個多級質譜解析和563個數據庫檢索獲得)。同時，相對定量結果表明，鎘脅迫條件下，水稻根部中的大部分羧基代謝物顯著降低，而地上部分中的95%以上的羧基代謝物含量都顯著升高，這表明水稻根部和地上部分可能在響應鎘脅迫時，在羧酸代謝水平采用了不同的應對策略。最后，代謝網絡分析表明，這些差異代謝物主要富集在苯甲酸族化合物代謝、苯丙氨酸代謝、苯基丙酸生物合成、脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸生物合成、亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝等8條路徑中。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

所有羧酸標準品購買自美國Sigma-Aldrich公司、北京百靈威公司、美國Cayman Chemical公司和上海阿拉丁公司。分析純的甲酸(88%)、2-氯-1-甲基碘化物(CMPI)、三乙胺(TEA)和N,N-二甲基乙二胺(DMED)購買自上海國藥集團；同位素標記試劑DMED-d4依照實驗室報道過的方法合成[16]；色譜純乙腈購于德國默克公司。TEA(10 μmol/mL)、CMPI(20 μmol/mL)、DMED(20 μmol/mL)、DMED-d4(20 μmol/mL)和有機酸(1 mg/mL)的儲備溶液均以色譜純ACN配制，-20 ℃冰箱中儲存。強陰離子交換-固相萃取柱(SAX-SPE，3 mL，200 mg)購自維泰克科技(武漢)有限公司；實驗中所用水均為Milli-Q超純水(美國Millipore公司純水儀制備)。

1.2 植物樣品的收集

秈稻品種(Oryza sativa ssp.indica cv.Zhenshan 97B)由中國水稻研究所-水稻生物學國家重點實驗室提供。種子在水培條件下萌發(fā)，然后移栽于Hoagland營養(yǎng)液中，于相對濕度70%～80%，光周期為16 h光照(28 ℃)、8 h黑暗(25 ℃)生長10天后，將一半植株用100 μmol/L Cd(NO3)2對大小均勻的幼苗進行鎘脅迫。正常組和脅迫組各做4組生物學平行和3組技術平行，脅迫7 d后分別收獲莖和根，稱重，液氮冷凍后，立即于-80 ℃貯藏。

1.3 樣品前處理和穩(wěn)定同位素標記

稱取水稻樣品100 mg，在液氮中研磨，并加入1 mL乙腈，然后置于黑暗條件下4 ℃提取過夜(12 h)，離心(10 000 g，20 min，4 ℃)，取上清液。樣品經SAX-SPE小柱純化[17]：用3 mL乙腈活化SPE柱后，上樣，然后分別用3 mL體積比1∶9 乙腈/水和3 mL體積比9∶1 乙腈/水清洗，最后加入3 mL解吸液(含1%甲酸的乙腈溶液)，收集解吸液，在40 ℃水浴加熱下，氮氣流吹干。

將純化后的樣品用200 μL乙腈復溶后，均分成兩份，向每份溶液中依次加入20 μL TEA(10 μmol/mL)和CMPI(20 μmol/mL)，渦旋混勻。然后在一份加入20 μL DMED(20 μmol/mL)，另一份加入DMED-d4(20 μmol/mL)，于40 ℃、1 500 r/min振蕩60 min，衍生化反應完成，在40 ℃水浴加熱下，氮氣流吹干。將輕重標記的樣品分別用100 μL體積比1∶9 乙腈/水復溶后合并，進行后續(xù)UPLC-MS分析。

1.4 實驗儀器和分析條件

質譜為Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer(美國，賽默飛公司)。液相系統為UltiMate 3000 UHPLC System，(美國，賽默飛公司)。色譜條件：AccucoreTMC18 Columns柱(150×2.1 mm,2.6 μm,美國賽默飛公司)，柱溫設置為40 ℃。0.1%脂肪酸水溶液作為流動相A，乙腈作為流動相B，梯度洗脫程序：0～5 min，5%B；5～45 min，5%～90%B；45～50 min，90%B；50～52 min，90%～5%B；52～60 min，5%B。流速：0.4 mL/min，進樣體積：10 μL。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，全掃描模式，掃描范圍為m/z180～600，儀器分辨率設置為120 000。離子傳輸毛細管溫度350 ℃，加熱塊溫度300 ℃，噴針電壓3.5 kV，鞘流氣35 psi，輔助氣15 psi。使用數據依賴采集模式(DDA)獲取多級質譜信息。通過CID碎裂模式對所篩查到的羧基化合物進行二級質譜分析，將MS3依賴于MS2中最強子離子進行三級分析。隔離寬度m/z2.0，活化時間為10 ms，掃描范圍為m/z50～600。MS2信息采集采用30%的歸一化碰撞能量，MS3設置為30%的歸一化碰撞能量。使用Mass Frontier Server Manager 7.0(美國賽默飛公司)輔助闡明羧基化合物結構。

1.5 數據處理

利用Thermo Compound Discoverer 2.1 Software(美國賽默飛公司)軟件對采集的初始數據抽提，得到保留時間(RT)、m/z和Intensity信息。通過計算保留指數(RI)來校正RT[18]。運用Matlab軟件對m/z相差4.025 Da、RI一致(輕重標記產物RI相差不超過1%)和峰強度一致(IntensityDMED-labeled/IntensityDMEDd4-labeled：0.76～1.50)的峰對進行匹配以篩選出候選化合物。利用Xcalibur 2.2.0(Thermo Fisher Scientific,USA)軟件，根據峰匹配得到的精確分子量信息，推測出標記產物的分子式，質量偏差為10 ppm，元素組成為C、H、O、N、S、Cl。通過本實驗室所建立的化學標記代謝物庫(Chemically Labeled Metabolite Database，CLMD，http://www.clmdb.cn/)對水稻中的羧基化合物進行比對確認，同時將模擬的分子式在Metlin(https://metlin.scripps.edu/landing page.php)和Massbank(https://massbank.eu/MassBank/)等數據庫中檢索相關羧基化合物，得到可能的候選物。通過鎘處理組與正常組的相對含量比(即Cd/normal)計算差異倍數(Fold Change，FC)，使用統計軟件IBM SPSS statistics 19.0，先對數據進行單因素方差分析得到p值，再通過綜合變異倍數分析(FC≥2 or ≤0.5)和p值(p<0.05)篩選出具有顯著性差異的羧基化合物。采用Microsoft Excel繪制熱圖。

2 結果與討論

2.1 水稻中羧基化合物的篩查

水稻是地球一半以上人類賴以生存的糧食作物，也是一種重要的模式植物，以水稻為研究對象，通過分析它在鎘脅迫條件下的代謝物種類和含量變化情況，有助于探索鎘脅迫相關的代謝途徑，研究植物中鎘脅迫的調控機制。本研究使用了一對輕重標記試劑(DMED和DMED-d4)來標記羧基化合物，通過引入易電離的叔胺基團，由負離子模式轉變成正離子模式檢測，提高了羧基化合物的離子化效率，增強其質譜檢測靈敏度，從而實現水稻中低豐度羧基化合物的分析篩查。具體工作流程如圖1所示。

圖1 水稻中羧基化合物篩查和定性的流程圖Fig.1 Workflow for screening and identification of carboxylic compounds in rice

首先，我們將正常生長和鎘脅迫處理后的樣品提取液等比例混合，再等分成兩份，分別用DMED和DMED-d4進行標記。然后，將輕標和重標標記的樣品按照1∶1(V/V)進行混合，進行LC-Orbitrap MS分析。圖2A為DMED/DMED-d4標記的水稻樣品的總離子流圖。在全掃描模式下，當抽提出的峰對符合以下三個條件：“輕”“重”標記的質量數相差4.025 Da、保留指數(RI)[18]一致和峰強度比一致時，認為是潛在的含羧基代謝物。如圖2B中的提取離子色譜圖所示，m/z為187.1799和191.2053的峰強度和保留指數一致，這類化合物被認為是潛在的羧基化合物。同時，輕重標記樣品的MS2信息和相應碎裂片段(圖2C)進一步展示了化合物的結構信息。

圖2 經DMED/DMED-d4標記的水稻樣品在LC-Orbitrap MS全掃模式下分析。(A)總離子流色譜圖；(B)m/z187.1799和m/z191.2053的己酸提取離子色譜圖；(C)標記的己酸二級質譜圖。Fig.2 DMED and DMEDd4 labeled rice analyzed by LC-Orbitrap MS under full scan mode.(A) Total ion current chromatogram of rice sample labeled by DMED and DMED-d4;(B) Extracted ion chromatograms of caproic acid at m/z187.1799 and m/z191.2053 from DMED/DMEDd4-labeled rice;(C) MS2 spectra of DMED/DMED-d4-labeled caproic acid.

運用該方法，實驗一共在水稻樣品中發(fā)現了1 444個可能的羧基化合物，表明水稻中存在著豐富的羧基化合物。其中，根部和地上部分中的代謝物種類有很大差異，分別測到771和1 044個羧基化合物，有371個化合物在根部和地上部分中均被檢測到(圖3A)。之前的報道在水稻中檢測到的羧基化合物種類不超過100種，本文實驗結果極大擴展了水稻中羧基化合物的種類。

圖3 韋恩圖顯示了鎘脅迫下根部(黃色)和地上部分(紫色)及二者共同含有的羧基化合物數量。(A)CIL-UPLC-MS分析中檢測到的羧基化合物數量；(B)根部和地上部分中含量有顯著差異性變化的羧基化合物數量；(C)根部和地上部分中含量顯著上調或下調的羧基化合物數量。Fig.3 Venn diagram showing the number of metabolites selected for Cd treatment in root(yellow),in shoot(purple) and commonly for both tissues.(A) Metabolites detected in CIL UPLC-MS analysis;(B) Metabolites showing a significant change;(C) Significant up-regulated and down-regulated metabolites in root and shoot under Cd stress.

2.2 水稻中羧基化合物的定性分析

本文對篩查到的羧酸化合物進行了定性分析。首先，將潛在羧基化合物的精確分子量、RI、MS2等信息與CLMD中的標準品信息進行比對，有72個羧基化合物可以與Chemically Labeled Metabolite Database(CLMD)(http://www.clmdb.com)中對應的標準品相匹配，同時通過標準品進一步驗證(level 1，No.1-72)；根據MS2等信息，推測出13個可能的羧基化合物結構(level 2，No.73-85)；將化合物的模擬分子式在Metlin(https://metlin.scripps.edu/)等數據庫中進一步搜索，可以獲得563個潛在的羧基化合物信息(level 3，No.86-648)；通過Xcalibur軟件，對剩余的796個化合物進行搜索，其中有691個化合物可以與精確的分子式匹配(level 4，No.649-1339)；另外105個化合物沒有得到精確的分子式(level 5，No.1340-1444)。level 4和level 5中的化合物，可能是水稻中存在的一些新的羧基化合物，將在以后對其做進一步的確認和研究。

2.3 水稻中羧基化合物的相對定量分析

進一步探索了鎘脅迫條件下水稻中羧基化合物含量的差異，對篩查到的1 444個潛在羧基化合物進行相對定量分析(圖4)。運用多元統計方法處理數據，結果表明，在鎘脅迫下水稻內檢測到486種羧基化合物含量具有顯著性差異，根部和地上部分中分別有159和365種羧基化合物含量表現出顯著差異，其中有38種在二者間均表現出顯著變化(圖3B)。

圖4 水稻中含羧基化合物的相對定量工作流程Fig.4 Overview of the procedure ford relative quantitation of carboxylic metabolites in rice

實驗發(fā)現根部中檢測到的大部分的羧基化合物含量顯著降低，而地上部分中絕大多數的羧基化合物含量都顯著升高。圖5A、5B顯示了鎘脅迫條件下根部和地上部分中羧基化合物的相對含量變化。在根部中，有38%(61個)的羧基化合物含量顯著升高，而62%(98個)的羧基化合物含量顯著降低。然而，在地上部分中，有95%(344個)羧基化合物含量都是顯著升高，只有5%(15個)的羧基化合物含量顯著降低(圖3C)。這表明水稻根部和地上部分在鎘脅迫時可能在羧酸代謝水平采用了不同的應對策略。

圖5 鎘脅迫條件下根部(A)和地上部分(B)中羧基化合物含量變化的火山圖。通過t檢驗計算各代謝物的p值，通過鎘處理組與正常組的相對含量比(即Cd/normal)計算fold change(FC)。以p<0.05,FC≥2或≤0.5為臨界值，紅色點表示鎘處理組中含量升高的羧基代謝物，藍色點表示鎘處理組中含量降低的羧基代謝物。黑點表示含量沒有明顯變化的羧基代謝物。Fig.5 Volcano plots of the carboxylic acids in root(A) and shoot(B) under Cd stress.The p -value of each metabolite was calculated from t-test,and the fold change(FC) was calculated from the peak ratios of Cd treated group and normal group(i.e.,Cd/normal).Using a cut-off value of p<0.05 and FC≥2 or ≤0.5,the red points represent the metabolites with higher concentrations in the Cd treated group,and the blue points represent the metabolites with lower concentrations in the Cd treated group.The black points represent the metabolites with no significant change.

圖6呈現了不同定性標準下的Cd脅迫后同一羧基化合物在根部和地上部分中的相對含量變化情況。5個level中顯著差異的羧基代謝物個數分別為：level 1(24個)、level 2(3個)、level 3(219個)、level4(206個)、level 5(34個)?？梢钥闯?，同一化合物在根部和地上部分中變化情況各異，如苯甲酸僅在地上部分中含量上升，而肉桂酸僅在根部中含量上升。值得注意的是，差異倍數增大或減小明顯的代謝物多在level 3和level 4水平，例如變化10倍以上的代謝物共有70個，level 3和level 4的占比分別是21%(15個)和69%(48個)。我們推測level 4中含有新的羧基化合物，且可能在鎘脅迫中發(fā)揮重要作用，對于將來緩解鎘脅迫的危害有重要意義。

圖6 鎘脅迫下顯著差異性含羧基代謝物的熱圖。以p<0.05,FC≥2或≤0.5為臨界值，紅色表示含量升高，藍色表示含量降低，白色表示含量沒有明顯變化，灰色表示未檢測到。Fig.6 Heat map of metabolites with significant changes under Cd stress.Using a cut-off value of p<0.05 and FC≥2 or ≤0.5,the red points represent the metabolites with higher concentrations in the Cd treated group,and the blue points represent the metabolites with lower concentrations in the Cd treated group.The white points represent the metabolites with no significant change.The gray points represent the undetected metabolites.

2.4 顯著性差異化合物的代謝網絡分析

為了進一步揭示鎘脅迫對水稻根部和地上部分中代謝穩(wěn)態(tài)的調節(jié)，對鑒定出的代謝物進行了代謝網絡分析。將篩查到的72個可以和標準品比對確認的羧基化合物(level 1)導入KEGG數據庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)中，獲得了這些化合物主要參與的代謝途徑。結果表明，其中37種羧基代謝物主要富集在8條代謝通路，分別為苯甲酸族化合物代謝、苯丙氨酸代謝、苯基丙酸生物合成、脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸生物合成、亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝。在這8條路徑中，鎘脅迫條件下根部中絕大多數可以檢測到的羧酸代謝物含量是無顯著變化或顯著降低的，而在地上部分中，含量發(fā)生顯著變化的代謝物的變化趨勢都是顯著升高的。這些結果進一步說明水稻根部和地上部分在鎘脅迫時可能在羧酸代謝水平采用了不同的應對策略。

圖7 鎘脅迫下水稻內部分含羧基化合物的代謝網絡圖。以p<0.05,FC≥2或≤0.5為臨界值，紅色表示含量升高，藍色表示含量降低，白色表示含量沒有明顯變化，灰色表示未檢測到。Fig.7 Metabolic network map of metabolites with significant changes under Cd stress.Using a cut-off value of p<0.05 and FC≥2 or ≤0.5,the red points represent the metabolites with higher concentrations in the Cd treated group,and the blue points represent the metabolites with lower concentrations in the Cd treated group.The white points represent the metabolites with no significant change.The gray points represent the undetected metabolites.

在重金屬脅迫條件下，有機酸能夠通過與金屬離子螯合來解毒，是重要的植物初級代謝產物。鎘脅迫條件下，在苯甲酸族化合物和苯基丙酸的代謝路徑中共檢測到6種有機酸。其中肉桂酸在根部中的含量升高，其下游代謝通路產物，苯甲酸和對香豆酸的含量在地上部分中均升高，進一步促進次生代謝，誘導大量酚類物質合成。酚類物質是植物體中的重要次生代謝產物，可與金屬離子發(fā)生絡合反應，或者通過去除自由基直接減弱氧化損傷，從而增強植物體自身防御系統[10]。在苯基丙酸生物合成路徑中，存在一系列酚酸，我們推測鎘可能誘導一系列中間代謝酚酸產物(咖啡酸和阿魏酸)的合成來響應脅迫。

酸性植物激素在鎘脅迫毒害下調節(jié)植物適應和存活起著關鍵作用。實驗中檢測到兩種羧基類植物激素生長素(IAA)和脫落酸(ABA)在鎘脅迫水稻地上部分中的含量均升高。ABA與水稻的鎘耐受性密切相關，水稻受到鎘脅迫后，為了阻止鎘在體內的快速轉運，會分泌大量ABA，從而抵抗脅迫。同時ABA的含量改變也會誘導IAA的含量變化，兩者共同協調，幫助植物抵御脅迫[1,9,10]。

脂肪酸(FAs)的生物合成主要發(fā)生在葉綠體基質中，飽和FAs經過去飽和作用可形成不飽和FAs。在植物細胞膜中，不飽和FAs含量的高低直接決定膜的流動性，影響植物對非生物脅迫的抗性。Chaffai等[20]發(fā)現脂類化合物與鎘脅迫條件下植物的生長調節(jié)密切相關。8條代謝路徑中有27種FAs化合物，其中地上部分中有4個FAs代謝物含量顯著上升，根部內有1個FAs代謝物含量上升，4個含量下降。脂氧合酶(LOX)可催化脂質過氧化形成丙二醛(MDA)等，在脅迫條件下，FAs降解和不飽和脂肪酸的代謝活躍，LOX活性明顯升高[21]。實驗中觀察到根部中不飽和FAs代謝通路上僅有花生四烯酸的含量上升，同時它的下游產物12-HETE和Leukotriene均能監(jiān)測到，表明鎘脅迫條件下，LOX可能催化了FAs的氧化裂解，導致膜脂過氧化程度升高，細胞膜的透性增加，造成氧化損傷。

3 結論

本文運用穩(wěn)定同位素標記結合UPLC-MS聯用技術，全面研究了水稻中羧基化合物的組成。最終發(fā)現了1 444個潛在羧基化合物，可以定性出其中的648個化合物(包括72個標準品確認，13個多級質譜解析和563個數據庫檢索獲得)。同時，通過統計學分析得到鎘脅迫下含量發(fā)生顯著性變化的化合物。結果表明，鎘脅迫條件下與正常條件下生長的水稻相比，水稻根部中大部分(62%)的羧基化合物含量顯著降低，而地上部分中絕大多數(95%)的羧基化合物含量顯著升高。進一步對這些化合物進行代謝網絡分析，發(fā)現化合物涉及苯甲酸代謝、脂肪酸的生物合成與降解等8條代謝路徑。這8條路徑中的羧基代謝也呈現了不同的變化趨勢。因此，推測水稻根部和地上部分在響應鎘脅迫時，可能在羧酸代謝水平上采用了不同的應對策略。該研究結果為從代謝物水平上揭示植物對鎘脅迫的適應機制提供了數據基礎，為進一步揭示植物應答鎘脅迫的響應機制提供了有力工具。