干佳玥, 楊保同, 趙大治

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科, 2骨科(河南洛陽(yáng) 471000)

骨質(zhì)疏松是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，由正常骨轉(zhuǎn)換異常導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間平衡性破壞引起，以骨微結(jié)構(gòu)改變，骨量和骨密度降低，易引發(fā)骨折為特點(diǎn)，是老年人主要的致殘和致死病因之一[1]。腸道菌群是人體最大最復(fù)雜的微生物群落，參與人體新陳代謝、免疫反應(yīng)過(guò)程[2]，腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致肥胖、代謝紊亂、自身免疫性疾病等疾病[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型中存在腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)改變[4]，腸道菌群失調(diào)可加重骨代謝紊亂，補(bǔ)充益生菌可增加健康個(gè)體的骨密度，預(yù)防雌激素缺乏以及繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[5]，提示腸道菌群與骨質(zhì)疏松存在一定聯(lián)系，但是目前國(guó)內(nèi)相關(guān)臨床報(bào)道仍十分少見(jiàn)。Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(type Ⅰ collagen breakdown products，β-CTX)是破骨細(xì)胞在骨吸收過(guò)程中降解產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物，可直觀反映骨吸收活性。骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，B-ALP)是成骨細(xì)胞分泌的參與骨質(zhì)代謝的特異性標(biāo)志物，可促進(jìn)鈣(Ca)吸收和磷(P)排泄，Ⅰ型前膠原氨基端前肽(N-terminal propeptide of type Ⅰ procollagen，PINP)則反映成骨細(xì)胞合成骨膠原的能力，是新骨形成的特異性敏感性指標(biāo)[6]。為明確腸道菌群失調(diào)與骨質(zhì)疏松之間關(guān)系，為臨床治療提供新的方向和策略，本研究特探討了腸道菌群與骨密度、骨代謝的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年1月至2021年12月我院收治的60例老年骨質(zhì)疏松患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)老年骨質(zhì)疏松癥診療指南(2018)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)年齡≥60歲；(3)入組前未進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松，糾正骨代謝失衡治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)骨密度正常者；(2)合并骨關(guān)節(jié)炎、骨結(jié)核、骨腫瘤、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、庫(kù)欣綜合征等影響骨代謝的疾病；(3)腸道急慢性感染，潰瘍性結(jié)腸炎，消化道腫瘤、高尿酸、高脂血癥、痛風(fēng)等可能引起腸道菌群失調(diào)疾病；(4)合并免疫疾病、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染者；(5)近6個(gè)月服用糖皮質(zhì)激素、抗甲狀腺、抗癲癇等影響骨代謝的藥物。

腸道菌群失調(diào)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]:(1)誘發(fā)腸道菌群失調(diào)原發(fā)??；(2)腹瀉、腹痛、腹脹等典型臨床癥狀；(3)糞便檢測(cè)球/桿菌比大于1∶3或糞便菌群涂片或培養(yǎng)提示非正常細(xì)菌增多，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。根據(jù)是否發(fā)生腸道菌群失調(diào)將患者分為腸道菌群正常骨質(zhì)疏松組(29例)和腸道菌群失調(diào)骨質(zhì)疏松組(31例)。另在同時(shí)段選擇51例老年胃腸道疾病患者(腸道菌群失調(diào)無(wú)骨質(zhì)疏松組)和于我院門診體檢中心體檢的60例老人為對(duì)照組，腸道菌群失調(diào)無(wú)骨質(zhì)疏松組、對(duì)照組均經(jīng)骨密度測(cè)量排除骨質(zhì)疏松，同時(shí)對(duì)照組排除胃腸道疾病、甲狀腺功能障礙、內(nèi)分泌異常、心腦血管疾病、肝腎功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病、肥胖、慢性阻塞性肺疾病等。本研究已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(201800618)，4組受試者均知情同意本研究?jī)?nèi)容和目的，簽署同意書。

腸道菌群失調(diào)骨質(zhì)疏松組、腸道菌群正常骨質(zhì)疏松組煙酒史比例、合并高血壓比例、合并糖尿病比例、合并高脂血癥比例高于對(duì)照組(P<0.013)，腸道菌群失調(diào)骨質(zhì)疏松組合并糖尿病比例高于腸道菌群正常骨質(zhì)疏松組(P<0.013)，其他比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.013)。見(jiàn)表1。

表1 各組基線資料比較

1.2 腸道菌群檢測(cè) 所有受試者入組后均采集患者糞便標(biāo)本，浸入1 mL TE buffer震蕩，采用Foregene Blood mini試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)提取腸道菌群DNA。SYBR Green熒光染料(購(gòu)自西安瑞禧生物科技有限公司)染色后，雅睿MA-6000熒光定量PCR儀(濟(jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司)上機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用克隆基因構(gòu)建的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算益生菌(雙歧桿菌、梭狀芽胞桿菌、韋榮氏球菌)，中性菌(大腸埃希菌、瘤胃球菌、腸球菌、毛螺科菌)、致病菌(糞便擬桿菌、單形擬桿菌、多行擬桿菌、諾迪擬桿菌)相對(duì)豐度。益生菌相對(duì)豐度降低，致病菌相對(duì)豐度增加為菌群失調(diào)。

1.3 骨密度、骨代謝檢測(cè) 骨密度：所有受試者入組后均采用美國(guó)Hologic Discovery A 型雙能X線骨密度儀測(cè)定髖關(guān)節(jié)、大轉(zhuǎn)子、股骨頸、胸腰椎的BMD值，取4個(gè)部位3次測(cè)量的平均值。骨代謝：所有受試者入組后第2天清晨采集靜脈血3 mL注入干燥試管，待血液自然凝固后取上層液離心(3 000 r/min，離心半徑15 cm，時(shí)間10 min)取血清上機(jī)檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法化驗(yàn)β-CTX、B-ALP、PINP，儀器為ALISEI全自動(dòng)酶標(biāo)儀(意大利SEAC公司)，試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群正常組和腸道菌群失調(diào)組腸道菌群豐富比較 雙歧桿菌、梭狀芽胞桿菌、韋榮氏球菌相對(duì)豐度在對(duì)照組、腸道菌群正常骨質(zhì)疏松組、腸道菌群失調(diào)無(wú)骨質(zhì)疏松組、腸道菌群失調(diào)骨質(zhì)疏松組依次降低(P<0.01)，糞便擬桿菌、單形擬桿菌、多行擬桿菌、諾迪擬桿菌相對(duì)豐度依次升高(P<0.01)。4組瘤胃球菌、毛螺科菌、大腸埃希菌、腸球菌比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 腸道菌群相對(duì)豐度差異

2.2 腸道菌群正常組和腸道菌群失調(diào)組骨密度和骨代謝指標(biāo)比較 骨密度、血清B-ALP、PINP水平在對(duì)照組、腸道菌群失調(diào)無(wú)骨質(zhì)疏松組、腸道菌群正常骨質(zhì)疏松組、腸道菌群失調(diào)骨質(zhì)疏松組依次降低(P<0.01)，血清β-CTX水平依次升高(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 腸道菌群正常組和腸道菌群失調(diào)組骨密度和骨代謝指標(biāo)的差異

2.3 腸道菌群與骨密度和骨代謝的相關(guān)性 雙歧桿菌、梭狀芽胞桿菌、韋榮氏球菌相對(duì)豐度與骨密度、B-ALP、PINP呈正相關(guān)(P<0.05)，與β-CTX呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，糞便擬桿菌、單形擬桿菌、多行擬桿菌、諾迪擬桿菌相對(duì)豐度與骨密度、B-ALP、PINP呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與β-CTX呈正相關(guān)(P<0.05)，瘤胃球菌、毛螺科菌、大腸埃希菌、腸球菌相對(duì)豐度與骨密度和骨代謝指標(biāo)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 腸道菌群與骨密度和骨代謝相關(guān)系數(shù)

2.4 老年骨質(zhì)疏松因素分析 以老年人骨質(zhì)疏松為因變量(賦值：0=否，1=是)，納入年齡、性別、體質(zhì)量、高血壓(賦值：0=否，1=是)、糖尿病(賦值：0=否，1=是)、腸道菌群失調(diào)(賦值：0=否，1=是)為自變量，向后逐步法排除無(wú)關(guān)變量，最終結(jié)果顯示糖尿病、腸道菌群失調(diào)是老年骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素(P<0.01)，見(jiàn)表5。校正糖尿病影響后腸道菌群失調(diào)(OR=1.307，95%CI：1.015～1.543,)仍與老年骨質(zhì)疏松的發(fā)生有關(guān)(P<0.01)。

表5 影響老年骨質(zhì)疏松的logistic回歸方程

3 討論

人類腸道菌群由1 000多種不同的微生物組成，正常人體腸道內(nèi)菌群之間相互依存和競(jìng)爭(zhēng)，與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，處于動(dòng)態(tài)平衡中，但是受飲食、環(huán)境、年齡、病理狀態(tài)等因素影響可發(fā)生不同程度菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致條件致病菌數(shù)量增加，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道上皮的營(yíng)養(yǎng)吸收，黏膜和全身免疫系統(tǒng)、跨腸道內(nèi)皮屏障信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等影響遠(yuǎn)處器官[8-9]，導(dǎo)致代謝疾病、營(yíng)養(yǎng)不良、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤和心血管疾病等[8，10-12]。隨著對(duì)腸道菌群研究的不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)與骨量丟失，骨質(zhì)疏松之間也存在一定關(guān)系[13]。

本研究腸道菌群失調(diào)骨質(zhì)疏松組腸道優(yōu)勢(shì)菌群豐度降低，機(jī)會(huì)致病菌豐富增加，同時(shí)伴骨密度降低，說(shuō)明腸道菌群紊亂可能與骨骼礦物質(zhì)流失以及骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。Li等[14]發(fā)現(xiàn)低骨密度者存在腸道菌群紊亂，擬桿菌屬數(shù)量增加，雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量減少與骨密度降低有關(guān)，隨著雙歧桿菌數(shù)量的增加骨密度也相應(yīng)地增加。Das等[15]團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者骨密度值的降低與腸道微生物群的改變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)無(wú)骨質(zhì)疏松組患者已出現(xiàn)骨密度下降，骨代謝異常，且腸道菌群失調(diào)骨質(zhì)疏松組患者表現(xiàn)更為嚴(yán)重，說(shuō)明腸道菌群失調(diào)在骨質(zhì)疏松未發(fā)生前已經(jīng)在某種程度上影響骨代謝和骨密度。經(jīng)回歸分析結(jié)果顯示腸道菌群失調(diào)是老年骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致老年人骨質(zhì)疏松的原因之一。研究顯示腸道菌群可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育，腸道菌群紊亂可抑制甾體激素生成，促使核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-17產(chǎn)生，促使外源性腎上腺皮質(zhì)激素生成抑制機(jī)體對(duì)鈣的吸收，促使破骨細(xì)胞分化[16]，導(dǎo)致骨量丟失。腸道菌群還可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)參與骨代謝調(diào)節(jié)，腸道微生物及其代謝物可促使Th 細(xì)胞活化和釋放大量促炎因子，誘導(dǎo)RANKL合成，促進(jìn)破骨細(xì)胞產(chǎn)生，影響骨代謝和重建[17]。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示益生菌豐度與骨密度、B-ALP、PINP呈正相關(guān)，與β-CTX呈負(fù)相關(guān)，而致病菌屬豐度則相反，表明腸道致病菌豐富增加、益生菌豐富降低可能引起骨代謝異常。研究顯示雙歧桿菌是腸道最常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌和有益菌，可調(diào)節(jié)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及維生素合成代謝滿足骨骼代謝所需養(yǎng)分，維持骨量，梭狀芽胞桿菌通過(guò)誘導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞分化參與腸道整體功能[18]和骨骼穩(wěn)態(tài)[19]的維持。梭狀芽胞桿菌可將腸道膳食纖維發(fā)酵并產(chǎn)生丁酸鹽，丁酸鹽是一種短鏈脂肪酸，可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞代謝和骨穩(wěn)態(tài)，具有刺激骨骼形成，增加骨量，抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收的作用[20]。韋榮氏球菌屬于厚壁菌門，參與大豆異黃酮在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為雌馬酚的過(guò)程[21]，而雌馬酚具有調(diào)節(jié)內(nèi)源性激素的作用，韋榮氏球菌減少將引起雌馬酚產(chǎn)生減少和雌激素缺乏，導(dǎo)致骨吸收抑制?？梢?jiàn)腸道菌群紊亂可能影響正常骨代謝，破壞骨穩(wěn)態(tài)平衡，進(jìn)而引起骨量流失和骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

本研究創(chuàng)新之處在于闡述了腸道菌群與老年骨質(zhì)疏松患者骨密度和骨代謝的關(guān)系，結(jié)果證實(shí)腸道菌群紊亂可能通過(guò)影響骨代謝導(dǎo)致骨量丟失和骨密度下降。但老年骨質(zhì)疏松患者腸道微生物通過(guò)何種途徑影響骨代謝和骨密度尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究不足之處為樣本例數(shù)偏少，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚，尚待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本例數(shù)，開(kāi)展多中心研究加以證實(shí)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：干佳玥、楊保同共同設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫。干佳玥同時(shí)負(fù)責(zé)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)、論文修改。楊保同同時(shí)負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。趙大治負(fù)責(zé)資料收集整理，論文審核。