王琪 周建華

（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240）

瓜蔞皮注射液為棕黃色的澄明液體，主要成分為瓜蔞皮提取液和注射用水。臨床上主要用于行氣除滿、開胸除痹、痰濁阻絡(luò)之冠心病、穩(wěn)定性心絞痛治療。作為中藥注射劑，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未制定細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查項(xiàng)。參考《中國藥典》2020版四部9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則，為加強(qiáng)臨床使用的安全性和制劑質(zhì)量的可控性，應(yīng)考慮設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)[1]。

1 材料和方法

1.1 儀器

ET-96細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；BET-48G6細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；XW-80A漩渦混旋器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；微量移液器（20～200 μL、100～1000 μL，Eppendorf公司）；無熱原吸咀（250 μL、1000 μL，湛江安度斯生物有限公司）；試驗(yàn)所用玻璃儀器均經(jīng)250 ℃干熱滅菌1 h以上。

1.2 試劑

瓜蔞皮注射液（批號1906201、1906202、1906203、1910201、1911201、1912201、2002201、2003201，規(guī)格4 mL，上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，批號150601-201784，規(guī)格80 EU/支，中國食品藥品檢定研究院）；鱟試劑[TAL，批號1903151，規(guī)格0.25 EU(0.1 mL)；批號1905241，規(guī)格0.125 EU(0.1 mL)；批號1804200，規(guī)格10～0.01 EU(1.35 mL)]、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET，批號1806120，規(guī)格5 mL/支）（湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑[TAL，批號1809292，規(guī)格0.125 EU(0.1 mL）]、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET，批號1811160，規(guī)格2 mL/支）（湛江博康海洋生物有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

參照《中國藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素限值L計(jì)算方法，L=K/M，注射劑K為5 EU/(kg·h)，M為每1 kg體質(zhì)量每1 h瓜蔞皮注射液最大靜脈滴注劑量（12 mL），人均體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，則成人理論L=5/(12/60)=25 EU/mL。依據(jù)《中國藥典》2020版四部通則9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則，限值設(shè)定可適當(dāng)嚴(yán)控至計(jì)算值的1/3～1/2，而歐美等國常以計(jì)算值的1/4作為標(biāo)準(zhǔn)，從使用安全性角度考慮，則將限值設(shè)定為＜6.25 EU/mL[1]。

1.3.2 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

參照中國藥典最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/λ的計(jì)算公式，則c為供試品溶液濃度等于1.0 mL/mL，在凝膠法中λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，最高為0.03 EU/mL，則MVD=1.0×6.25/0.03=208；在動態(tài)濁度法中λ為所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度0.01 EU/mL，則MVD=1.0×6.25/0.01=625[1]178-181。故確定采用凝膠法時(shí)瓜蔞皮注射液的最大有效稀釋倍數(shù)為208，采用動態(tài)濁度法時(shí)則最大有效稀釋倍數(shù)為625，驗(yàn)證時(shí)的稀釋倍數(shù)不應(yīng)超過其最大有效稀釋倍數(shù)。

1.3.3 凝膠法干擾試驗(yàn)

1）干擾預(yù)實(shí)驗(yàn) 選擇λ=0.25 EU/mL的低靈敏度鱟試劑進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)。取瓜蔞皮注射液用BET制成25、50、100、200倍稀釋濃度的供試品溶液，各濃度取0.1 mL，分別加入鱟試劑0.1 mL，每一濃度平行做2次，作為供試品陰性對照（NPC）；同時(shí)用各稀釋倍數(shù)下的供試品溶液同比例加入1.0 EU/mL細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成含細(xì)菌內(nèi)毒素0.5 EU/mL的溶液，各取0.1 mL，分別加入鱟試劑0.1 mL，每一濃度平行做2次，作為供試品陽性對照（PPC）；另取2支鱟試劑，加入BET水作為陰性對照（NC）；取2支，加入0.5 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為陽性對照（PC），混勻，用封口膜封口，置于凝膠儀中于37 ℃孵育60 min[2-3]。

2）干擾試驗(yàn) 選擇預(yù)實(shí)驗(yàn)下的無干擾稀釋倍數(shù)下的供試品溶液和BET，分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（EU/mL）的系列溶液，用2批來自不同廠家的TAL進(jìn)行試驗(yàn)，每一濃度平行做4管[3-4]。同時(shí)做陰性對照和供試品對照各2管。λC可根據(jù)公式λC＝antilg(∑lgX/n)計(jì)算，式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度，n為每個(gè)濃度的平行管數(shù)。

3）樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 另取5個(gè)不同生產(chǎn)批號的瓜蔞皮注射液，用BET將瓜蔞皮注射液稀釋成由干擾試驗(yàn)確定的稀釋倍數(shù)下的供試液，按《中國藥典》2020版第四部通則1143的方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

1.3.4 光度測定法——?jiǎng)討B(tài)濁度法

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn) 取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，加入1 mL BET水，漩渦15 min，用BET水依次稀釋制成1.0、0.1、0.01 EU/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度平行做3管，并以BET水作為陰性對照，進(jìn)行自動檢測[2-3]。

2）干擾試驗(yàn) 根據(jù)凝膠法確定的MVD，把瓜蔞皮注射液稀釋50倍后作為供試液，平行做2管；將瓜蔞皮注射液稀釋25倍，與濃度為0.2 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1∶1混合得含細(xì)菌內(nèi)毒素0.1 EU/mL的供試品陽性對照液（稀釋倍數(shù)為50倍），平行做2管。

2 結(jié)果

2.1 凝膠法干擾試驗(yàn)

采用TAL 1903151的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將瓜蔞皮注射液稀釋50、100、200倍時(shí)，2管NPC均為陰性，2管PPC均為陽性，則可認(rèn)為在這些稀釋倍數(shù)下均無干擾；而稀釋25倍時(shí)，有時(shí)會有干擾（表1）。為操作方便和準(zhǔn)確，選擇供試品的最小不干擾稀釋倍數(shù)為50，并以此進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

表1 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)

分別使用湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司靈敏度（λ）=0.125 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明不同廠家的鱟試劑，鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ（即0.063～0.250 EU/mL）范圍內(nèi)，鱟試劑靈敏度試驗(yàn)符合要求，瓜蔞皮注射液在稀釋50倍時(shí)，λc亦在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，干擾試驗(yàn)有效，認(rèn)為供試品在該稀釋倍數(shù)下不存在干擾作用（表2）。

表2 瓜蔞皮注射液稀釋50倍后的干擾試驗(yàn)

依據(jù)干擾試驗(yàn)確定的條件另取5批其他批號的瓜蔞皮注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定（表3）。

表3 瓜蔞皮注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

綜合凝膠法干擾試驗(yàn)結(jié)果，瓜蔞皮注射液按上述實(shí)驗(yàn)條件可確立該樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。瓜蔞皮注射液稀釋50倍后試驗(yàn)反應(yīng)物不干擾，可選擇靈敏度為0.125～0.03 EU/mL的鱟試劑作為日常的凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測[4-5]。

2.2 動態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)及干擾試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線lgT=2.663 93－0.276 75lgC，相關(guān)系數(shù)r=－0.999 9，相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.980；陰性對照的反應(yīng)時(shí)間均大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間；變異系數(shù)均小于10%；供試品陽性對照的細(xì)菌內(nèi)毒素回收率均在50%～200%[6-7]。這些結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線是可靠的。選用靈敏度為10～0.01 EU/mL的鱟試劑，供試品溶液稀釋至50倍，供試品在此試驗(yàn)條件下不存在干擾作用，干擾試驗(yàn)有效（表4）。

動態(tài)濁度法的檢測結(jié)果表明，3批瓜蔞皮注射液在稀釋了50倍后供試液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量分別為0.008 4、0.014 4 EU/mL及未檢出，折合原液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量為0.42、0.72 EU/mL，均小于限值6.25 EU/mL，符合相關(guān)規(guī)定（表4）。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)及樣品干擾試驗(yàn)

（續(xù)表4）

從凝膠法和動態(tài)濁度法的干擾試驗(yàn)結(jié)果來看，瓜蔞皮注射液在稀釋50倍后無干擾作用，兩種方法試驗(yàn)結(jié)果一致。兩種方法均可進(jìn)行瓜蔞皮注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，日常檢驗(yàn)可任選其一。

3 討論

類似瓜蔞皮注射液等的中藥制劑，其成分相對復(fù)雜，易受到原料產(chǎn)地、生產(chǎn)工藝等干擾因素影響，控制其細(xì)菌內(nèi)毒素對于人體用藥安全有重要意義[8-9]。采用動態(tài)濁度法可較為準(zhǔn)確地檢測出樣品中真實(shí)的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，但根據(jù)現(xiàn)行中國藥典規(guī)定，當(dāng)測定結(jié)果有爭議時(shí)，目前尚以凝膠法的結(jié)果為準(zhǔn)，故本研究建立的兩種方法可為互補(bǔ)。然而，鱟作為國家二級保護(hù)動物，堪稱海洋里的遠(yuǎn)古遺民，有“生物活化石”之稱，考慮到現(xiàn)在國家對于海洋動物鱟的保護(hù)，一些細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的新方法也有報(bào)道，如重組C因子法等[10]，以減少鱟試劑的使用量。但目前各廠家重組C因子質(zhì)量差異較大，還須進(jìn)行深入的研究才能作為國標(biāo)用于注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。