郭利華 胡桂梅 丁 勇 王靜靜 葉國良

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江寧波 315020

miR–100 位于人染色體11q24.1，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等細(xì)胞信號途徑，與正常組織比較，miR–100 在腫瘤組織中表達(dá)異常[1-3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胃上皮細(xì)胞感染幽門螺桿菌后miR–100 表達(dá)異常，與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相關(guān)信號通路相關(guān)[4]，進(jìn)一步對胃癌細(xì)胞系進(jìn)行miR–100 檢測，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞miR–100 較胃黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)下降，考慮miR–100 可能參與胃癌發(fā)展進(jìn)程。miR–100 作為miR–99 家族中的重要成員，研究已證實(shí)其與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)miR–100 表達(dá)降低[1,3,5]。mTOR 是miR–100 靶基因之一，miR–100 可通過調(diào)控mTOR等靶基因表達(dá)發(fā)揮抑癌作用[4,5]。本項(xiàng)目擬采用miR–100 模擬劑轉(zhuǎn)染BGC–823 細(xì)胞，檢測miR–100對胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及對蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/mTOR 信號通路的影響，探討胃癌細(xì)胞增殖、凋亡與 miR–100 調(diào)控Akt/mTOR 信號通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株BGC–823、SGC–7901、MKN–45和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES–1 均購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT–PCR）引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司；轉(zhuǎn)染試劑mimics、inhibitor、mock及mTOR–WT、mTOR–MUT 購于Invitrogen 公司；RPMI–1640、MEM、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于Invitrogen 公司；Total RNA抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScript RT Master Mix 購于Spark Jade 公司；RIPA 裂解液購于Spark Jade 公司；CCK–8 試劑盒、Annexin V–FITC 凋亡試劑盒購于Bioss 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗及二抗均購于CST公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選擇對數(shù)生長期的BGC–823 細(xì)胞種植于6 孔板中（每孔3×104～5×104個(gè)）；將miR–100 模擬劑（mimics）、對照（mock）和LipofectamineTM2000試劑分別稀釋至適量的Opti–MEM無血清培養(yǎng)基中，在室溫下放置5min。將miR–100 mimics 和對照組分別與LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫下放置20min。最后將轉(zhuǎn)染復(fù)合體（siRNA–LipofectamineTM2000 復(fù)合物）分別加入每一個(gè)包含50%～60%細(xì)胞的培養(yǎng)孔中。在培養(yǎng)箱孵育，按相應(yīng)實(shí)驗(yàn)需要收集細(xì)胞。

1.3 CCK–8 實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，向96 孔板加入細(xì)胞100μl/孔（約1×103個(gè)）。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h 及72h，向各孔加入10μl 的CCK–8 細(xì)胞增殖檢測溶液，培養(yǎng)箱中孵育2h，使用伯樂酶標(biāo)儀在450nm 波長處檢測每孔的吸光度值。每組共設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 細(xì)胞周期

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h 后，將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，細(xì)胞離心后接著用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌2 次，每次1000g 離心5min；棄上清后用預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃過夜；細(xì)胞離心后去除乙醇，PBS 洗滌2 次，然后加5μl 的RNA酶（5g/L），室溫條件下處理15min；每管內(nèi)加5μl的碘化丙啶（propidiumIodide，PI）染色液，室溫避光情況下孵育30min；1h 內(nèi)流式檢測，應(yīng)用ModFit LT?軟件分析細(xì)胞周期結(jié)果。

1.5 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h 后，將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集5×105個(gè)細(xì)胞，以PBS 洗滌，加入400μl 的Binding Buffer，將細(xì)胞混勻，再添加5μl 的Annexin V–FITC 溶液，混勻后于4℃避光反應(yīng)15min，加入PI 染色液，繼續(xù)在4℃反應(yīng)10min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

用Trizol 裂解液萃取細(xì)胞總RNA，測濃度后反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA，用miScript SYBR Green PCR kit進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT–PCR）檢測，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30s，PCR反應(yīng)95℃ 5s，60℃ 34s，共40 個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2–??Ct法測定基因的相對表達(dá)量，以U6、GAPDH 為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，所用引物見表1。

1.7 靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證

將miR–100 的mimics 或其空載體與載有野生型mTOR–WT 質(zhì)?；蚩兆冃蚼TOR–MUT 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BGC–823 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h 后收集細(xì)胞，通過酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞熒光素酶活性，以海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶活性比值判斷細(xì)胞活性。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法

用RIPA 裂解液抽取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度。蛋白樣品中添加5×Loading buffer 放入沸水中5min 使其變性。每孔加入等量的蛋白樣品，恒壓電泳，取出已完成電泳的SDS–PAGE 膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液中封閉1h 后，PVDF 膜加入一抗，在4℃冰箱過夜，TBST 洗膜，然后在室溫下孵育二抗1h，TBST 洗膜，ECL 顯色，X 光片曝光、顯影，GAPDH 作為內(nèi)參，結(jié)果分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用One–way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用LSD–t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞株miR–100 表達(dá)降低

胃黏膜上皮細(xì)胞株 GES–1 與胃癌細(xì)胞株BGC–823、SGC–7901、MKN–45 的miR–100 相對表達(dá)量依次為0.998±0.221、0.386±0.043、0.690±0.072、0.494±0.057，胃癌細(xì)胞株miR–100 表達(dá)量均顯著低于胃黏膜上皮細(xì)胞株（F=13.727，P=0.002），見圖1。miR–100 在BGC–823 中表達(dá)水平最低，因此選擇BGC–823 進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 胃癌細(xì)胞株與胃黏膜上皮細(xì)胞株miR–100 表達(dá)水平比較

2.2 轉(zhuǎn)染miR–100 對BGC–823 胃癌細(xì)胞增殖的影響

miR–100 mimics 組miR–100 表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.01）。miR–100 mimics 組48h 450nm 的吸光度值顯著低于對照組[（0.823±0.059）vs（1.133±0.112），t=4.894，P=0.003]，72h 450nm 的吸光度值顯著低于對照組[（1.017±0.075）vs（1.343±0.112），t=6.937，P<0.001]，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染miR–100 對BGC–823 細(xì)胞增殖的影響

2.3 轉(zhuǎn)染miR–100 對BGC–823 細(xì)胞周期的影響

miR–100 mimics組G0/G1期細(xì)胞比率顯著高于對照組[（65.59%±0.86%）vs（55.82%±0.64%），t=15.865，P<0.001]，S 期細(xì)胞比率顯著低于對照組[（23.98%±1.24%）vs（27.02%±0.81%），t=6.324，P=0.003]，G2/M 期細(xì)胞比率顯著低于對照組[（10.32%±1.82%）vs（17.15%±0.45%），t=3.553，P=0.024]，見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染miR–100 對BGC–823 細(xì)胞周期的影響

2.4 轉(zhuǎn)染miR–100 對BGC–823 細(xì)胞凋亡的影響

miR–100 mimics 組細(xì)胞凋亡率（11.26%±1.46%）略高于對照組（9.05%±1.23%），但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.594，P=0.060），見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染miR–100 對BGC–823 細(xì)胞凋亡的影響

2.5 miR–100 靶基因雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證

在轉(zhuǎn)染克隆有mTOR–WT 基因3'UTR 質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR–100 mimics 組細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于對照組[（0.46±0.05）vs（1.05±0.08），t＝10.780，P<0.001]；在轉(zhuǎn)染克隆有mTOR–MUT 基因3'UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，miR–100 mimics 組和對照組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.01±0.07）vs（0.95±0.06）；t＝1.540，P=0.198]，見圖5。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miRNA‐100 對靶基因mTOR 調(diào)控作用

2.6 miR–100 對BGC–823 胃癌細(xì)胞Akt/mTOR 表達(dá)的影響

BGC–823 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h 后，胃癌細(xì)胞中Akt、mTOR、p70S6K mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.05），而PI3K mRNA 及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖6。

圖6 BGC–823 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h 后Akt/mTOR 信號通路表達(dá)變化

3 討論

研究顯示miR–100 影響腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程[2,6-8]。Cao 等[3]研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，胃癌組織中miR–100 表達(dá)水平顯著降低；Peng 等[9]發(fā)現(xiàn)與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES–1比較，數(shù)種胃癌細(xì)胞株如SUN–1、AGS 及HGC–27的miR–100 表達(dá)水平顯著降低，本研究結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞株miR–100 表達(dá)水平顯著低于胃黏膜上皮細(xì)胞株，與既往研究結(jié)果相符，提示miR–100 可能參與胃癌的發(fā)病過程。

通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR–100 模擬劑轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞BGC–823，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染48h、72h 后細(xì)胞增殖率較對照組顯著降低，表明miR–100 可降低胃癌細(xì)胞增殖活性。Ye 等[10]研究證實(shí)miR–100–5p模擬劑可抑制前列腺癌LNCaP、PC–3 細(xì)胞系的增殖活力，同時(shí)還可抑制LNCaP、PC–3 細(xì)胞的侵襲與遷移。流式細(xì)胞儀檢測分析結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，S 期及G2/M 期細(xì)胞比率明顯下降，表明miR–100 轉(zhuǎn)染使胃癌細(xì)胞周期發(fā)生變化。Peng 等[9]研究發(fā)現(xiàn)AGS 胃癌細(xì)胞株miR–100 過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而MGC–803 胃癌細(xì)胞株miR–100 低表達(dá)對細(xì)胞凋亡無明顯影響。推測miR–100對細(xì)胞凋亡的影響可能與胃癌細(xì)胞分化程度有一定相關(guān)性，本研究結(jié)果提示miR–100 mimics 組細(xì)胞凋亡率雖略高于對照組，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，miR–100 對胃癌細(xì)胞凋亡的影響仍有待進(jìn)一步研究。

TargetScan 分析發(fā)現(xiàn)miR–100 有包括mTOR、FZD5、FZD8、IGF1R 在內(nèi)的多個(gè)靶基因，閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，以上靶基因與胃癌均有相關(guān)性。Lin 等[11]通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)mTOR 是miR–100 的目的基因之一。因此本研究將mTOR 作為目的基因，通過熒光報(bào)告驗(yàn)證野生型mTOR 轉(zhuǎn)染后熒光活性明顯受抑制，mTOR 表達(dá)下調(diào)明顯。因此，可認(rèn)為mTOR是miR–100 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要靶基因。

mTOR 是Akt 下游關(guān)鍵底物之一，研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Akt/mTOR 信號通路相關(guān)基因也存在異常表達(dá)，Akt/mTOR 異常活化可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞惡性增殖、凋亡受阻、周期轉(zhuǎn)運(yùn)加速，并促使腫瘤血管再生和細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[12,13]。Akt/mTOR 信號通路參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞周期、凋亡及血管新生等腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過程[14]。在腦腫瘤、乳腺癌、卵巢癌等研究中發(fā)現(xiàn)Akt/mTOR 蛋白酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)能加速細(xì)胞周期、相對縮短G1期，使細(xì)胞增殖異?；钴S，減少細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤迅速生長[15-17]。mTOR 激活可使下游核糖體S6 蛋白激酶（p70S6K）磷酸化，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[16]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株BGC–823轉(zhuǎn)染后，Akt/mTOR 信號通路Akt、mTOR、p70S6K基因及蛋白表達(dá)明顯降低，而Akt、mTOR 及p70S6K是細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控等細(xì)胞進(jìn)程中的重要分子，影響這些基因及蛋白的表達(dá)勢必影響細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期等活動，而miR–100 mimics 具有抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程的作用。

綜上，miR–100 在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，miR–100 靶向調(diào)控mTOR 抑制胃癌細(xì)胞增殖，阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程，可能與調(diào)控Akt/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。