勵(lì) 超 錢 飚 魯洪豐 李旭軍

中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院乳腺外科，浙江寧波 315000

三陰性乳腺癌（triple–negative breast cancer，TNBC）是女性最常見的惡性腫瘤之一，作為復(fù)雜的疾病類型，其表現(xiàn)出明顯的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[1,2]。研究表明，晚期乳腺癌通?？赊D(zhuǎn)移到骨、肝、肺和腦等遠(yuǎn)處器官[3]，優(yōu)化當(dāng)前乳腺癌的臨床治療方法以尋找新型診療方案仍是目前的研究熱點(diǎn)。Polo樣蛋白激酶1（Polo–like kinase1，PLK1）是PLK 家族成員之一，是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。現(xiàn)已知PLK1 在大多數(shù)腫瘤中高度表達(dá)，如骨肉瘤、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等，并與患者的腫瘤細(xì)胞增殖和預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。此外，通過抑制PLK1 免受蛋白酶體降解能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，提示PLK1 可能是治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)[7]。目前，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制和現(xiàn)代生物技術(shù)的深入探索，自體免疫細(xì)胞療法對腫瘤治療發(fā)揮重要作用，其中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine–induced killer cell，CIK 細(xì)胞）是用于免疫治療的常見免疫效應(yīng)細(xì)胞，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或?qū)е录?xì)胞死亡，并分泌相關(guān)細(xì)胞因子以促進(jìn)抗腫瘤作用，具有殺瘤活性高和識別能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[8]。鑒于此，本研究旨在探究抑制PLK1 表達(dá)聯(lián)合CIK 細(xì)胞作用下對乳腺癌細(xì)胞的影響，以期為該疾病的治療提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級BALB/c 裸鼠40 只，雌性，4～6 周齡，體質(zhì)量18～20g，飼養(yǎng)室溫度22～24℃、相對濕度（50±5）%且每日光照/黑暗交替12h，飼養(yǎng)環(huán)境經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理，期間自由飲水與攝食，適應(yīng)性飼喂1 周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會審批通過（批件號：SL–NBEY–KY–2022–045–03）。

1.1.2 細(xì)胞 TNBC細(xì)胞株MDA–MB–231購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.3 主要試劑 PLK1 抑制劑BI–2536 購于美國Selleck 公司，γ 干擾素（interferon–γ，IFN–γ）購于美國PeproTech 公司，白細(xì)胞介素–2（interleukin 2，IL–2）購于北京四環(huán)生物制藥有限公司，CD3McAb購于美國Corning 公司，MTT 試劑盒和蘇木精–伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司，Annexin V–FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，PVDF 膜購于美國Millipore公司，蛋白裂解液、BCA 蛋白檢測試劑盒及ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液購于上海碧云天生物研究所，免疫組織化學(xué)染色（DAB 顯色）試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司，PerCP–CD3、FITC–CD4、APC–CD8、FITC–CD56 抗體及兔抗人Ki–67 多克隆、兔抗人胱天蛋白酶（caspase）–3、兔抗人caspase–9、兔抗人GAPDH 多克隆抗體購于英國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 CIK 細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定 收集健康志愿者（倫理號：SX–NBEY–TY–2022–122–12）外周靜脈血30ml 置于肝素抗凝管，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，置于37℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，收集細(xì)胞，加入含1000U/ml INF–γ 與20%人血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基，在孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后加入400U/ml IL–2 和50 ng/ml CD3McAb 繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2d 換液1 次，同時(shí)補(bǔ)足1000 U/ml IL–2。分別取分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)第12 天的CIK 細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，以1000 轉(zhuǎn)/min 離心5min，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，取100μl 細(xì)胞懸液置于干凈離心管，分別加入PerCP 熒光標(biāo)記的CD3、FITC熒光標(biāo)記的CD4、APC 熒光標(biāo)記的CD8、FITC 熒光標(biāo)記的CD56 抗體，充分混勻后，4℃避光靜置30min，PBS 洗滌2 遍，加入4%多聚甲醛固定液重懸沉淀，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.2 MTT法 將MDA–MB–231細(xì)胞添加至含10%胎牛血清和1%青–鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)貼壁后，常規(guī)傳代培養(yǎng)。通過BI–2536、CIK 細(xì)胞及BI–2536 聯(lián)合CIK 細(xì)胞處理MDA–MB–231 細(xì)胞后，檢測各處理組細(xì)胞存活率。①BI–2536 對MDA–MB–231 細(xì)胞存活率的影響：將對數(shù)生長期的MDA–MB–231 細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，以1×103個(gè)/孔的密度植入96 孔培養(yǎng)板，在孵箱培養(yǎng)24h 后，分別換用含1、2.5、5、10、20μmol/L BI–2536 的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h 后，每孔加入20μl MTT（5mg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄原液，加入150μl DMSO 至細(xì)胞孔，充分振蕩，待孔內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶全部溶解后，采用酶標(biāo)儀檢測各細(xì)胞孔A490值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。②CIK 細(xì)胞對MDA–MB–231細(xì)胞存活率的影響：將消化后的MDA–MB–231 細(xì)胞調(diào)整密度至1×104個(gè)/ml 作為靶細(xì)胞，將CIK 細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ml 作為效應(yīng)細(xì)胞；依次按照5∶1、10∶1、20∶1、40∶1 的效靶比例將CIK 細(xì)胞與MDA–MB–231 細(xì)胞共植入96 孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h 后，根據(jù)MTT 法檢測各細(xì)胞孔A490值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。③BI–2536 聯(lián)合CIK 細(xì)胞對MDA–MB–231 細(xì)胞存活率的影響：將消化后的MDA–MB–231 細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度植入96 孔培養(yǎng)板，設(shè)置對照組、BI–2536 組（5μmol/L BI–2536 處理MDA–MB–231 細(xì)胞48h）、CIK組（效靶比為10∶1的CIK細(xì)胞處理MDA–MB–231細(xì)胞48h）、BI–2536+CIK 組（5μmol/L BI–2536 與效靶比為10∶1的CIK細(xì)胞共同處理MDA–MB–231細(xì)胞48h），處理完成后，根據(jù)MTT 法檢測各細(xì)胞孔A490值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 取1.2.2 ③處理后的各組MDA–MB–231 細(xì)胞，PBS 洗滌，0.25%胰酶消化，PBS 再洗滌后，使用染料結(jié)合緩沖液重懸制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，取100μl 細(xì)胞懸液移入干凈離心管，依次加入5μl Annexin V–FITC 和5μl PI，渦旋混勻，室溫避光孵育10min 后，通過流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡水平。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 通過蛋白裂解液提取各組MDA–MB–231 細(xì)胞的總蛋白，BCA 法蛋白定量后，加入SDS 上樣緩沖液，沸水浴處理5min，制備12% SDS–PAGE 凝膠，將蛋白樣品加入凝膠孔內(nèi)，電泳分離蛋白，以220mA、120min 轉(zhuǎn)膜條件電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，并置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h。分別加入稀釋的一抗caspase–3（1∶1000）和caspase–9（1∶1000），4℃孵育過夜；次日，TBST 室溫洗膜，再加入稀釋的對應(yīng)二抗（1∶5000），室溫孵育1h，TBST 洗膜，將膜采用ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，暗室曝光，以GAPDH 作為內(nèi)參，利用ImageJ 1.8.0 軟件計(jì)算各蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.5 裸鼠移植瘤模型的建立與分組處理 將正常培養(yǎng)的MDA–MB–231 細(xì)胞密度調(diào)整為1×108個(gè)/ml，將BALB/c 裸鼠右下腹部消毒，通過微量注射器取200μl 細(xì)胞懸液推注于裸鼠右側(cè)腋窩處，夾緊針孔以防滲漏。接種后，每日觀察裸鼠生長狀態(tài)與腫瘤長出情況。待瘤體生長達(dá)到約100mm3時(shí)，選擇32 只瘤體大小與形態(tài)較為一致的裸鼠，按數(shù)字表法隨機(jī)分成4組，每組8 只。①對照組：與給藥組等容積的生理鹽水灌胃，尾靜脈注射200μl 生理鹽水；②BI–2536 組：以10mg/kg BI–2536（溶于含30%PEG–400、0.5%Tween–80和5%丙烯的生理鹽水）灌胃，每2d 一次；③CIK 組：取200μl CIK 細(xì)胞（1×106個(gè)/ml）進(jìn)行尾靜脈注射，一周2 次；④BI–2536+CIK 組：以10mg/kg BI–2536灌胃，每2d 一次，并取200μl CIK 細(xì)胞（1×106個(gè)/ml）進(jìn)行尾靜脈注射，一周2 次。持續(xù)觀察各組裸鼠腫瘤生長，用游標(biāo)卡尺測量瘤體，每隔2d 測量一次；21d后處死所有裸鼠，無菌環(huán)境下解剖取出瘤體，清洗干凈后電子天平稱重，將一部分組織固定在10%福爾馬林中，一部分置于液氮迅速冷凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.6 HE染色 取10%福爾馬林中固定好的裸鼠移植瘤組織，常規(guī)脫水透明，制備成石蠟塊，在切片機(jī)上連續(xù)切成4μm 的組織切片，將其以二甲苯脫蠟與梯度酒精脫水處理后，置于Harris 蘇木精中染色5min，流水沖洗干凈，在切片上滴入1%鹽酸/乙醇分化數(shù)秒，沖洗干凈后，加入伊紅染色3min，再經(jīng)過脫水、透明處理，中性樹膠封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察各腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長狀況，并攝取圖像。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色 將制備的腫瘤組織切片在烤箱高溫處理1h，常規(guī)脫蠟水化，滴加檸檬酸鈉加熱修復(fù)抗原，0.3%過氧化氫液室溫孵育10min，PBS 沖洗浸泡，組化筆畫圈標(biāo)記，10%山羊血清室溫封閉，分別滴加稀釋后的兔抗人Ki–67 多克隆抗體（1∶100）、兔抗人caspase–3 多克隆抗體（1∶200）和兔抗人caspase–9 多克隆抗體（1∶200），4℃冰箱內(nèi)孵育過夜；次日，棄原液，PBS 沖洗后，圈內(nèi)滴加稀釋后的對應(yīng)二抗（1∶5000），室溫繼續(xù)孵育1h。再次洗滌切片后，利用DAB 進(jìn)行顯色，流水沖洗，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，通過光學(xué)顯微鏡觀察組織內(nèi)細(xì)胞著色情況并拍攝圖像，胞質(zhì)、胞核染為棕色至棕褐色為陽性，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，通過ImageJ 1.8.0 軟件分析蛋白陽性染色面積，以陽性染色面積與總面積之比表示各蛋白的陽性表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8.30 繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次。采用單因素方差分析進(jìn)行多組重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較，LSD–t檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)兩兩數(shù)據(jù)比較。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIK 細(xì)胞鑒定

與誘導(dǎo)前比較，CIK 細(xì)胞經(jīng)過14d 體外誘導(dǎo)擴(kuò)增后，CIK 細(xì)胞亞群中CD3+CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞比例均顯著增加（P<0.05），而CD3+CD4+細(xì)胞比例顯著減少（P<0.05），見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+CD8+、CD3+CD56+ 及CD3+CD4+細(xì)胞比例

2.2 抑制PLK1 及CIK 細(xì)胞對TNBC 細(xì)胞的增殖抑制

與對照組比較，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯下降，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2A。不同效靶比的CIK 細(xì)胞作用于MDA–MB–231 細(xì)胞后，細(xì)胞存活率隨著效靶比的增加而降低，呈效靶比依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2B。

圖2 MTT 法檢測各組MDA–MB–231 細(xì)胞存活率

2.3 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細(xì)胞對TNBC 細(xì)胞的增殖抑制作用

與對照組比較，BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細(xì)胞存活率均顯著下降（P<0.05）；而與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組的細(xì)胞存活率進(jìn)一步顯著下降（P<0.05），見圖3。

圖3 MTT 法檢測各組的MDA–MB–231 細(xì)胞存活率

2.4 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細(xì)胞對TNBC 細(xì)胞凋亡的影響

BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照組（P<0.05）；BI–2536+CIK 組的細(xì)胞凋亡率顯著高于BI–2536 組和CIK 組（P<0.05），見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組的MDA–MB–231 細(xì)胞凋亡率

2.5 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細(xì)胞對TNBC 細(xì)胞中caspase–3 與caspase–9 蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細(xì)胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均顯著增加（P<0.05）；與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組細(xì)胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均進(jìn)一步顯著增加（P<0.05），見圖5。

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組中的MDA–MB–231 細(xì)胞中的caspase–3 與caspase–9 蛋白水平

2.6 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細(xì)胞對TNBC 裸鼠移植瘤生長的影響

在第6、9、12、15、18、21 天時(shí)，BI–2536 組和 CIK 組裸鼠腫瘤組織體積顯著小于對照組（P<0.05），而相較于 BI–2536 組和 CIK 組，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織體積進(jìn)一步顯著縮?。≒<0.05），見圖6A。與對照組比較，BI–2536 組和 CIK 組裸鼠腫瘤質(zhì)量顯著減少（P<0.05），BI–2536+CIK 組的腫瘤組織質(zhì)量顯著小于BI–2536組和CIK 組（P<0.05），見圖6B、圖6C。

圖6 各組裸鼠腫瘤組織體積與質(zhì)量測定

2.7 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細(xì)胞對TNBC 裸鼠腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞生長的影響

通過HE 染色觀察到對照組裸鼠腫瘤組織內(nèi)染色均勻，細(xì)胞排列密集，生長狀態(tài)良好；相較于對照組，BI–2536 組和CIK 組裸鼠腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞排列較為稀疏，數(shù)目明顯減少；而與BI–2536 組和CIK組比較，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞進(jìn)一步減少，且形態(tài)不規(guī)則，見圖7。

圖7 各組大鼠腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞生長（HE 染色，×100）

Ki–67 蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，caspase–3和caspase–9 蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分定位于細(xì)胞核，呈彌漫分布。與對照組比較，BI–2536組和CIK 組裸鼠腫瘤組織內(nèi)Ki–67 陽性率顯著減少（P<0.05），caspase–3 陽性率和caspase–9 陽性率均顯著增加（P<0.05）；而與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織內(nèi)Ki–67 陽性率顯著減少（P<0.05），caspase–3 陽性率和caspase–9陽性率則均顯著增加（P<0.05），見圖8。

圖8 各組腫瘤組織內(nèi)Ki–67、caspase–3 及caspase–9 表達(dá)

3 討論

乳腺癌作為一種高度異質(zhì)性的疾病，不同患者的臨床治療和預(yù)后差異較大?；诨蚧钚詸z測已確定10 余個(gè)不同的疾病亞型，TNBC 是一種特定的乳腺癌亞型，不表達(dá)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor 2，HER2），臨床特征表現(xiàn)為侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移潛能高、易復(fù)發(fā)和預(yù)后差[9]。由于TNBC 缺乏ER、PR 和HER2表達(dá)，對內(nèi)分泌治療不敏感且缺乏有效的治療靶點(diǎn)，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化的TNBC 治療方案。因此，開發(fā)新型TNBC 治療策略迫在眉睫。

PLK1包含保守的N末端激酶催化域和Polo–box結(jié)構(gòu)域，參與磷酸化的激活與亞細(xì)胞定位調(diào)節(jié)。PLK1幾乎調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的各個(gè)階段，此外，其還在調(diào)節(jié)微管動(dòng)力學(xué)、染色體動(dòng)力學(xué)、p53 活性、DNA 復(fù)制和損傷修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。目前，已揭示PLK1 在多種腫瘤中存在過表達(dá)現(xiàn)象，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)[4-6,10]。Maire 等[11]研究發(fā)現(xiàn)TNBC 中PLK1 的表達(dá)水平高于乳腺癌A型、B 型和HER2 過表達(dá)型，提示PLK1 是TNBC的潛在治療靶點(diǎn)；Ren 等[12]研究表明PLK1 能促進(jìn)TNBC 腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和克隆形成，是TNBC 發(fā)生過程中的關(guān)鍵Hub 基因，推動(dòng)乳腺癌惡性進(jìn)展。鑒于此，研究者認(rèn)為以PLK1 作為治療靶點(diǎn)開發(fā)藥物對個(gè)體化 TNBC 治療具有很大前景。BI–2536 是PLK1 的ATP 結(jié)合域抑制劑，可在低納摩爾濃度下與PLK1 的激酶域結(jié)合并抑制其活性，使腫瘤細(xì)胞有絲分裂和周期進(jìn)程異常，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過不同劑量BI–2536 處理MDA–MB–231 細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯下降；此外，BI–2536作用于移植瘤裸鼠后其腫瘤體積和質(zhì)量均減小，腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞生長與增殖均受抑制，由此說明BI–2536 對體內(nèi)外乳腺癌腫瘤細(xì)胞生長均表現(xiàn)出抑制作用。

CIK 細(xì)胞是從人外周血單核細(xì)胞中收獲的異質(zhì)免疫效應(yīng)細(xì)胞，經(jīng)幾種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而來，對腫瘤細(xì)胞顯示出廣泛的主要組織相容性復(fù)合體非限制性殺瘤活性，能夠通過釋放穿孔素、顆粒酶B、細(xì)胞溶解素等殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。與其他免疫細(xì)胞相比，CIK細(xì)胞具有增殖能力強(qiáng)、抗腫瘤譜廣及抗腫瘤活性強(qiáng)等特點(diǎn)。然而，CIK 在治療TNBC 中仍面臨諸多問題，由于TNBC 惡性程度高且轉(zhuǎn)移快速，部分患者在確診時(shí)已處于晚期，此時(shí)患者的免疫功能較低，激活抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力差，且由于腫瘤組織已建立免疫抑制環(huán)境，使得CIK 細(xì)胞難以發(fā)揮作用[14]。近年來，一些基礎(chǔ)研究和臨床研究都強(qiáng)調(diào)CIK 細(xì)胞與其他化療藥物、靶向藥物或免疫療法相結(jié)合，能夠獲得有效而持久的抗腫瘤效果。Chen 等[15]研究表明，卡培他濱節(jié)拍化療聯(lián)合自體CIK 細(xì)胞免疫療法對治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性TNBC 有效，可提高患者的免疫功能和生活質(zhì)量，并延長無進(jìn)展生存期；Li 等[16]研究揭示CIK 細(xì)胞免疫治療與TNBC 預(yù)后之間的關(guān)系，表明CIK 細(xì)胞免疫治療可提高TNBC 患者常規(guī)化療的效果，且不良反應(yīng)較少；孔娟等[17]研究說明CIK細(xì)胞聯(lián)合腫瘤靶向藥物西妥昔單抗對表皮生長因子受體陽性的野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞與突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞均顯示出較強(qiáng)的殺傷效應(yīng)。本研究中，通過將CIK 細(xì)胞與PLK1 抑制劑BI–2536 聯(lián)合作用于體外MDA–MB–231 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合作用下的腫瘤細(xì)胞活性更低，細(xì)胞凋亡率更高，體內(nèi)乳腺癌裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出CIK 細(xì)胞聯(lián)合BI–2536 作用下的瘤體生長進(jìn)一步減緩，抑瘤作用更強(qiáng)。由此推測，CIK 細(xì)胞聯(lián)合PLK1 抑制劑BI–2536 可增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

Caspase 是一個(gè)進(jìn)化保守的半胱氨酸蛋白酶家族，主要參與細(xì)胞死亡和炎性反應(yīng)，是由大小不一的氨基末端結(jié)構(gòu)域和約20kDa、10kDa 的大、小催化亞基所組成的蛋白酶結(jié)構(gòu)域，共包含15 個(gè)家族成員，其中caspase–3 是一種典型的凋亡執(zhí)行者，在被啟動(dòng)子caspase–9 激活后裂解細(xì)胞內(nèi)多個(gè)具有關(guān)鍵功能的蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前，許多抗癌療法，包括細(xì)胞毒性藥物、放射療法或免疫療法，都能夠通過激活caspase–3 來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或死亡[18,19]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CIK 細(xì)胞聯(lián)合BI–2536 處理的MDA–MB–231 細(xì)胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均增加，同時(shí)，乳腺癌移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)也表現(xiàn)出caspase–3、caspase–9 蛋白表達(dá)增加的現(xiàn)象，提示CIK 細(xì)胞聯(lián)合BI–2536 可通過進(jìn)一步誘導(dǎo)caspase 依賴性途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用。

綜上，使用PLK1 抑制劑BI–2536 聯(lián)合CIK 細(xì)胞能夠在體內(nèi)和體外增強(qiáng)對TNBC 腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，該作用機(jī)制可能與進(jìn)一步激活caspase 依賴性途徑相關(guān)。靶向抑制PLK1 與CIK 細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用有可能成為一種新型有效的抗腫瘤治療方案用于TNBC 的臨床應(yīng)用中。