茹美華 劉迎博 李建強(qiáng)，2

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一類病因不明的的慢性進(jìn)行性肺間質(zhì)疾病，患病人數(shù)較多，疾病預(yù)后相對(duì)較差。細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡方式。很多研究表明，細(xì)胞焦亡在呼吸系統(tǒng)疾病尤其是肺纖維化的發(fā)病中起著重要作用，炎性小體等相關(guān)因素可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本文就細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制及其參與肺纖維化發(fā)生發(fā)展及治療方面的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

細(xì)胞焦亡概述

細(xì)胞死亡的方式主要分為兩大類，即程序性死亡和非程序性死亡，其中細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞自主死亡方式，主要包括細(xì)胞凋亡(apoptosis)、壞死性凋亡(necroptosis)、細(xì)胞焦亡(pyroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)、自噬(autophagy)和胞葬(efferocytosis)[1]。非程序性死亡主要指細(xì)胞壞死。

細(xì)胞焦亡的信號(hào)通路主要分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路，其中經(jīng)典的細(xì)胞焦亡通路由Caspase-1介導(dǎo)，而非經(jīng)典通路由Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11介導(dǎo)。最初Hilbi[2]等于1997年發(fā)現(xiàn)在福氏志賀菌感染巨噬細(xì)胞后能引起Caspase-1依賴的程序性細(xì)胞死亡，觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞腫脹的同時(shí)細(xì)胞膜發(fā)生破裂，使得胞內(nèi)物質(zhì)釋放進(jìn)而引發(fā)炎性反應(yīng)[3]，最終Cookson[4]于2001年將這種在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的這種Caspase-1依賴的細(xì)胞死亡方式稱之為細(xì)胞焦亡(pyroptosis)。細(xì)胞焦亡的特征是質(zhì)膜完整性的喪失和細(xì)胞內(nèi)容物及炎癥因子(如IL-1β,IL-18等)的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂，釋放內(nèi)容物，并導(dǎo)致天然免疫應(yīng)答的進(jìn)一步激活，引起一系列炎性反應(yīng)[5]。

一、細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡的區(qū)別

細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、發(fā)生及調(diào)控機(jī)理等均有別于凋亡等其他細(xì)胞死亡方式[6]。

1 細(xì)胞焦亡表現(xiàn)為明顯的DNA片段化,而細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為核固縮和凋亡小體的形成。2 細(xì)胞焦亡過(guò)程中涉及的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶主要包括介導(dǎo)經(jīng)典途徑的Caspase-1和非經(jīng)典途徑的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11[7-9]，不伴有Caspase-3和ADP-ribose聚合酶(PARP)的活化[10]。3 細(xì)胞焦亡過(guò)程中，細(xì)胞膜發(fā)生破裂，釋放炎性介質(zhì)，并引起炎性反應(yīng)；而細(xì)胞凋亡過(guò)程中不涉及炎癥反應(yīng)，且細(xì)胞膜保持完整。4 細(xì)胞焦亡依賴Caspase-1活性，抑制caspase-1可以阻止細(xì)胞焦亡，但不能阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死[6]。

二、細(xì)胞焦亡激活的經(jīng)典通路

細(xì)胞焦亡的經(jīng)典通路是由Caspase-1介導(dǎo)，其關(guān)鍵步驟是炎性小體的組裝和Caspase-1的招募活化[11]，不僅存在于單核巨噬細(xì)胞系，還存在于樹突狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等其他細(xì)胞中[12-13]，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。但Caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡主要發(fā)生在巨噬細(xì)胞中，一個(gè)可能的解釋是巨噬細(xì)胞可能表達(dá)更高水平的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性[11]，其確定性仍需進(jìn)一步的細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證明。炎性小體是由多組蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，主要包括模式識(shí)別受體(pattern recognitionreceptors，PRRs)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated-speck-like protein containing a CARD，ASC)及Caspase-1前體(pro-caspase-1)[14]。其中PRR的NOD樣受體(NLR)可以識(shí)別PAMP和DAMP以啟動(dòng)經(jīng)典炎性體途徑，目前發(fā)現(xiàn)的有NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2等[15]。ASC 是一種接頭蛋白，主要由N端的PYD、C端的CARD組成，PYD和CARD是同源的蛋白間相互作用結(jié)構(gòu)域，在ASC的寡聚化中起著類似橋梁的作用。pro-caspase-1是效應(yīng)分子，其被活化后能夠特異性地作用于GSDMD蛋白。

炎性小體復(fù)合物的組裝始于PRRs識(shí)別特定的刺激，刺激的類型包括病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和宿主來(lái)源的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)。當(dāng)特定刺激被識(shí)別后，PRRs發(fā)生寡聚化將N端的PYD結(jié)構(gòu)域與ASC蛋白同源的PYD結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，ASC再通過(guò)CARD-CARD結(jié)構(gòu)域的相互作用從而募集Caspase-1，完成炎性小體的組裝[16]。將Caspase-1前體(pro-Caspase-1)活化成caspase-1，后者一方面切割GSDMD蛋白，另一方面活化前體IL-1β、IL-18為有活性的IL-1β、IL-18，引起炎性物質(zhì)釋放，引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)，這就是細(xì)胞焦亡的經(jīng)典通路。

三、細(xì)胞焦亡激活的非經(jīng)典通路

不依賴Caspase-1的焦亡被稱為非經(jīng)典焦亡途徑[17-19]，細(xì)胞焦亡的非經(jīng)典通路主要由Caspase-4和Caspase-5介導(dǎo)，在小鼠中為Caspase-11介導(dǎo)。細(xì)胞受到細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)的刺激后，前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶直接與細(xì)菌脂多糖結(jié)合并被活化[20]，而不需要其他胞內(nèi)受體(如NLRP3等)的介導(dǎo)。非經(jīng)典通路中，前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的CARD直接與脂多糖的脂質(zhì)A部分相互作用，引起前者顯著構(gòu)象重排。這些原天冬氨酸蛋白酶的構(gòu)象變化導(dǎo)致利用其CARD寡聚，從而使自身蛋白水解的活性受到限制。與經(jīng)典通路相比，Caspase-11的寡聚直接涉及CARD，而Caspase-1的CARD用于ASC結(jié)合，而不是寡聚[21-22]。寡聚后，Caspase-11在D285后自動(dòng)與MEAD/A序列一起水解GSDMD[23-24]，獲得了完全的蛋白水解活性。與裂解pro-IL-1β、IL-18和GSDMD的Caspase-1不同，活化的Caspase-4、5、11被認(rèn)為只識(shí)別GSDMD，并在hGSDMD的D275或mGSDMD[23-24]的D276處切割，從而產(chǎn)生焦性孔隙，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡。

四、細(xì)胞焦亡的效應(yīng)蛋白

Gasdermin D(GSDMD)位于8號(hào)染色體(8q24.3)，是由一個(gè)31 kDa的N端和一個(gè)22 kDa的C端通過(guò)肽鏈連接而成的蛋白質(zhì)。2015年Shi J.等[23]研究發(fā)現(xiàn)DGSDMD是Caspase誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的最終效應(yīng)蛋白，其可以被炎性Caspase激活，抑制GSDMD的C端結(jié)構(gòu)域并釋放其N端結(jié)構(gòu)域，后者具有膜磷脂上膜打孔活性，可與細(xì)胞膜磷脂酰肌醇結(jié)合形成孔洞(約10～16 nm)，破壞細(xì)胞膜完整性[25]，導(dǎo)致水分內(nèi)流，細(xì)胞腫脹、破裂。另一方面可以激活無(wú)生物活性IL-1β和IL-18的前體，使其形成具有生物活性的IL-1β和IL-18并釋放至細(xì)胞外，募集炎癥細(xì)胞聚集，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[26]，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。此外，其他GSDM家族成員GSDMA3、GSDMA、GSDME等也具有類似的功能。

細(xì)胞焦亡與肺纖維化

肺纖維化是一種肺間質(zhì)的慢性疾病，主要是由肺泡上皮損傷引起的細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白沉積，從而導(dǎo)致肺臟的不可逆性損傷的纖維化疾病[27]。組織學(xué)表現(xiàn)為程序性死亡，在較小程度上，壞死細(xì)胞夾雜著增生和不典型的2型上皮細(xì)胞[28]。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的呼吸困難及低氧血癥，發(fā)病率呈不斷上漲趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人們的健康和生活質(zhì)量。

研究顯示，炎性小體的啟動(dòng)和激活可以使肺泡上皮細(xì)胞焦亡，并能進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)及肺纖維化的進(jìn)展[29]。在不同局部環(huán)境因素的刺激下，巨噬細(xì)胞可分為兩種不同的極化狀態(tài)：經(jīng)典激活表型(M1)和交替激活表型(M2)[30]。在肺纖維化中，參與的巨噬細(xì)胞主要為M2型巨噬細(xì)胞。當(dāng)外界或體內(nèi)的刺激因子作用于肺細(xì)胞時(shí)，PRRs可識(shí)別刺激類型，聯(lián)合ASC與Caspase-1組成炎性小體，活化Caspase-1后?；罨腃aspase-1一方面切割GSDMD蛋白破壞肺細(xì)胞膜的完整性，另一方面使IL-1β和IL-18成熟與分泌，募集巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞聚集，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)。其中裂解的巨噬細(xì)胞不僅促使IL-1、IL18等的分泌，還會(huì)導(dǎo)致M2巨噬細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)釋放，從而促進(jìn)肺成纖維化細(xì)胞的增殖和分化及肺細(xì)胞的炎癥反正，參與肺纖維化的發(fā)生[31-32]。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，還可以促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的聚集促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生。IL-18一方面參與肺纖維化的炎癥過(guò)程，另一方面還與肺組織損傷后的重建過(guò)程如肺間質(zhì)纖維化、血管壁增厚和上皮細(xì)胞再生等有關(guān)，這些炎性因子的釋放表明細(xì)胞焦亡促進(jìn)了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的纖維化模型中，NLRP3缺陷小鼠支氣管肺泡灌洗液中表達(dá)水平與對(duì)照組相比，中性粒細(xì)胞流入減少，IL-1β水平降低，小鼠炎性反應(yīng)減弱，炎性細(xì)胞及炎性因子較少，纖維化標(biāo)志物(TIMP-1)的水平相應(yīng)降低，表明博來(lái)霉素阻止肺纖維化的進(jìn)展；；而普伐他汀可作用于P2X7受體，可增強(qiáng)炎性小體的活化，從而增加肺纖維化的風(fēng)險(xiǎn)[33-34]。Hussain[35]等研究發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管(MWCNT)誘導(dǎo)初級(jí)人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞焦亡，通過(guò)激活NLRP3炎性小體導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞焦亡，來(lái)啟動(dòng)肺纖維化進(jìn)程。Pamela[36]等在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠中發(fā)現(xiàn)，NLRP3缺陷小鼠支氣管肺泡灌洗液中Caspase-1的激活、IL-1β生成均減少。孟瀟瀟等[37]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明在百草枯中毒中，可能存在KCa3.1激活促使細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流，增高NEK7表達(dá)，進(jìn)一步激活NLRP3炎癥小體，介導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生。以上這些研究表明細(xì)胞焦亡通過(guò)炎性小體形成釋放炎性因子引起炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，表明調(diào)控炎性小體尤其是NLRP3的形成可能成為治療肺纖維化的一個(gè)突破點(diǎn)。但是對(duì)于其他的炎性小體的作用機(jī)制目前仍未完全明確，其在肺纖維化中的重要作用仍需進(jìn)一步的積極探索。

細(xì)胞焦亡在肺纖維化治療中的進(jìn)展

吡非尼酮和尼達(dá)尼布是近期批準(zhǔn)用于治療肺纖維化的藥物，兩者均可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β等的分泌，抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生，減輕肺纖維化及肺部炎癥，前者在脂多糖誘導(dǎo)的模型中發(fā)揮重要作用[38]，后者則在聚六亞甲基胍磷酸(PHMG-P)誘導(dǎo)的模型中發(fā)揮重要作用[39]。Song等[40]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明與吡非尼酮化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的氟苯尼酮可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體的激活，降低Caspase-1和IL-1β水平，減輕肺纖維化。雖然目前的臨床藥物有效的改善了肺纖維化患者的生存率，但是其費(fèi)用高、有一定的不良反應(yīng)，也限制了這些藥物在臨床中的應(yīng)用，因此繼續(xù)開發(fā)新的藥物是非常必要的。

王鵬飛[41]等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以抑制Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞焦亡過(guò)程，顯著改善了BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。此外，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，Caspase-1抑制劑YVAD具有緩解肺纖維化的能力，并可逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓引起的肺纖維化[23, 42-43]。Tang等[44]發(fā)現(xiàn)虎杖苷在肺炎支原體感染的小鼠中可以逆轉(zhuǎn)肺炎支原體誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的NLRP3炎癥體和NF-κB途徑的激活、Caspase-3表達(dá)、促纖維化相關(guān)蛋白TGF-SMA、膠原I和膠原Ⅲ的上調(diào)，抑制細(xì)胞焦亡從而改善肺纖維化，并抑制肺部炎癥，表明虎杖苷可以抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，作為肺纖維化潛在的治療藥物。一些植物中提取到的成分也被證明可以通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡從而改善肺纖維化。實(shí)驗(yàn)證明從石蒜科植物中提取的生物堿LYC可以靶向ASC和阻斷ASC與NLRP3的相互作用，減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的炎性小體激活和細(xì)胞焦亡，并且發(fā)現(xiàn)LYC能顯著降低Caspase-1的釋放和IL-1β的成熟形式[45]，以上研究表明LYC可能通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡中NLRP3炎性小體活化而成為治療肺纖維化的潛在藥物。雖然LYC已經(jīng)在國(guó)外被作為治療肺部急性炎癥的藥物，但是其在肺纖維化中的治療作用，仍需大量的研究驗(yàn)證及臨床效果證明。Withaferin A(WA)是從睡蓮屬植物中分離得到的一種C5，C6-環(huán)氧甾體內(nèi)酯。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明WA治療的卵清蛋白誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠體內(nèi)I型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TIMP-1和波形蛋白的mRNA表達(dá)及TGF-β1、成纖維細(xì)胞活化與成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(FSP1)，纖連蛋白和波形蛋白等均減低，并且細(xì)胞焦亡相關(guān)的NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA水平也顯著降低，提示W(wǎng)A在肺纖維化及肺部炎癥的治療中有效[46]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，含有聚六亞甲基胍磷酸(PHMG-P)的加濕器消毒劑導(dǎo)致肺損傷和呼吸衰竭，其特征是細(xì)支氣管閉塞和隨后的大量肺纖維化[47]。Kim等[48]實(shí)驗(yàn)證明小豆中分離得到的齊墩果酸乙酸酯(OAA)通過(guò)降低PHMG-P處理的小鼠肺中NLRP3、ASC和Caspase-1的水平抑制肺纖維化進(jìn)展。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞也可通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡抑制肺纖維化。Zhao等人[49]發(fā)現(xiàn)人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)其免疫抑制和抗纖維化功能保護(hù)肺免受肺纖維化的影響。月經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(MenSCs)的外體let-7可靶向LOX1調(diào)節(jié)NLRP3信號(hào)，從而抑制ROS激活和線粒體DNA損傷，MANSC分泌的外切體可能通過(guò)影響ROS的產(chǎn)生和mtDNA損傷而對(duì)肺纖維化和肺泡上皮細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用[50]。此外，積雪草酸(Asiatic acid，AA)亦可以通過(guò)抑制炎性小體NLRP3的激活抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生，減輕肺纖維化[51]。細(xì)胞焦亡在肺纖維化中起重要作用，通過(guò)阻斷炎性小體的激活、Caspase-1、IL-1β和IL-18等因子的釋放，抑制細(xì)胞焦亡可能是改善肺纖維化患者預(yù)后的重要途徑，為肺纖維化的治療展開了新的方向。但是目前對(duì)于炎性小體的NLRP3的研究較為多見(jiàn)，其他炎性小體NLRP1、NLRC4、AIM2等在肺纖維化中的作用機(jī)制仍不明確，抑制NLRP3的同時(shí)是否抑制了細(xì)胞焦亡其他因子，及對(duì)其抑制作用程度是否相同，仍需通過(guò)相應(yīng)的功能實(shí)驗(yàn)及對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明。

小結(jié)

肺纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素共同作用的病理生理過(guò)程。細(xì)胞焦亡的激活可介導(dǎo)炎癥參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，而抑制Caspase-1、IL-1β和IL-18等細(xì)胞因子釋放，調(diào)控細(xì)胞焦亡通路的活化，繼而可以減輕肺組織炎癥，緩解肺纖維化的進(jìn)展。但是仍有以下問(wèn)題需要進(jìn)一步的思考：(1)細(xì)胞焦亡與巨噬細(xì)胞尤其是M2型巨噬細(xì)胞的極化相應(yīng)的信號(hào)通路及影響因素，可以通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞焦亡的纖維化模型進(jìn)一步驗(yàn)證巨噬細(xì)胞極化與細(xì)胞焦亡共同作用的因子；(2)炎性小體在肺泡上皮EMT的具體機(jī)制及誘發(fā)因素，可以在多種不同環(huán)境下構(gòu)建肺纖維化動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證EMT發(fā)生的不同速度；(3)是否細(xì)胞焦亡相關(guān)的其他因子也可以抑制肺泡上皮EMT，可以構(gòu)建細(xì)胞焦亡的肺纖維化動(dòng)物模型探討除了NLRP3外的其他細(xì)胞焦亡相關(guān)因子對(duì)肺細(xì)胞的作用；(4)抑制細(xì)胞焦亡的相關(guān)藥物是否可以作為肺纖維化的臨床用藥，可以通過(guò)構(gòu)建藥物的動(dòng)物模型探討其可能產(chǎn)生的毒副作用。因此鑒于細(xì)胞焦亡在肺纖維化的發(fā)病機(jī)理中具有廣泛而有效的作用，進(jìn)一步研究細(xì)胞焦亡的確切機(jī)制為治療和診斷肺纖維化提供新的可能性和新的治療靶點(diǎn)是非常必要的。