吳儷媛陳夢冰李夢華邱士偉喬月華張巖時(shí)晰,*

1徐州醫(yī)科大學(xué)聽覺與平衡醫(yī)學(xué)研究所(徐州 221004)

2江蘇省人工聽覺重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(徐州 221004)

3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床聽力中心(徐州 221006)

4福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科(福州 350005)

5暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（深圳市人民醫(yī)院）(深圳 518020)

6吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(長春 130021)

Waardenburg綜合征(Waardenburg syndrome，WS)，又被稱為聽覺-色素綜合征，它是引起綜合征性耳聾的最常見的原因之一，與2%-5%的先天性耳聾病例有關(guān)。WS遺傳方式主要為單基因致病的常染色體顯性遺傳伴不全外顯[1,2]。WS屬神經(jīng)嵴疾病之一，是由于神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育異常而導(dǎo)致的一組臨床癥候群。荷蘭眼科學(xué)家及遺傳學(xué)家Waardenburg[2]于1951年首次報(bào)道并以其名字命名該綜合征。

全世界范圍不同人種及不同性別均有病例報(bào)道，據(jù)推測白色人種WS人群發(fā)病率為1/42 000，占先天性耳聾的1.43%。在我國，楊淑芝等[3]對(duì)來自18個(gè)省份（自治區(qū)）及2個(gè)直轄市的30個(gè)聾校或聾兒康復(fù)機(jī)構(gòu)的2466名在校學(xué)生進(jìn)行抽樣調(diào)查，共采集到WS病例17例，構(gòu)成比為0.69%；其中Ⅰ型病例9例，Ⅱ型病例8例，未收集到Ⅲ型和Ⅳ型病例，我國先天性聾啞兒童患者中WS患者可能比國外少，但目前缺少對(duì)WS的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查研究。

目前根據(jù)附加體征，WS病例被進(jìn)一步分為4個(gè)亞型。Waardenburg綜合征I（WS1）伴內(nèi)眥異位，Waardenburg綜合征II（WS2）不伴內(nèi)眥異位，Waardenburg綜合征 III（WS3）合并上肢異常，又稱Klein-Waardenburg綜合征，Waardenburg綜合征VI（WS4）常伴先天性巨結(jié)腸等胃腸道畸形及周圍神經(jīng)脫髓鞘病變、中樞髓鞘形成障礙等神經(jīng)病學(xué)改變，又稱Waardenburg-Shah綜合征。根據(jù)W指數(shù)可以區(qū)分兩種類型：W>1.95為WS1，W<1.95為WS2[4]。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，與WS明確相關(guān)的基因有6個(gè)，分別為MITF、PAX3、EDNRB、EDN3、SOX10及SNAI2，這些基因相互作用，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中占有不同地位[5-7]。EDNRB（endothelin receptor type B）基因即內(nèi)皮素受體B型基因，對(duì)神經(jīng)嵴發(fā)育的起到調(diào)控作用，其蛋白屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G Proteincoupled receptor,GPCR)的視紫紅質(zhì)超家族。在EDNRB中，純合子和不太頻繁的雜合子突變導(dǎo)致WS2和WS4的產(chǎn)生[8]。本文主要對(duì)EDNRB基因在Waardenburg綜合征中所扮演角色予以詳細(xì)綜述。

1 EDNRB基因及其蛋白結(jié)構(gòu)的概述

EDNRB基因和蛋白質(zhì)在脊椎動(dòng)物中呈高度保守狀態(tài)[9]。人源性EDNRB基因位于13號(hào)染色體上，其含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。人源性EDNRB全長442氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量約為50kDa，與EDNR序列同源性為64%。小鼠、大鼠、牛、山羊和豬的EDNRB長度在441-443個(gè)氨基酸范圍內(nèi)，與人EDNRB具有高度的序列同源性[10]。EDNRB在許多組織中均有表達(dá)，特別是在結(jié)腸粘膜下層的肌間神經(jīng)叢、粘膜層、神經(jīng)節(jié)和血管中表達(dá)較高[11]。

EDNRB蛋白屬于GPCR的視紫紅質(zhì)超家族，由一個(gè)長的胞外末端序列、7個(gè)螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domains,TMDs)、3個(gè)細(xì)胞外環(huán)和3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)以及一個(gè)細(xì)胞質(zhì)C末端組成。其中TMD I-III和VII以及相鄰的細(xì)胞外回路構(gòu)成了激動(dòng)劑結(jié)合結(jié)構(gòu)域。TMD IV-VI和鄰近的細(xì)胞外環(huán)參與受體的選擇性結(jié)合，與羧基末端尾部構(gòu)成信號(hào)傳導(dǎo)域。EDNRB的翻譯后修飾主要包括棕櫚?；?、磷酸化和潛在的糖基化。定點(diǎn)突變和[3H]棕櫚酸研究結(jié)果表明，人源性EDNRB羧基尾部存在三個(gè)半胱氨酸殘基(Cys402、403和405)是潛在的棕櫚?；稽c(diǎn)。C端棕櫚?；潭瓤赡苡绊懪cG-蛋白的偶聯(lián)及影響下游信號(hào)通路和EDNRB磷酸化。目前已經(jīng)確定了13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，主要集中在C端(435-442AA)。EDNRB磷酸化可能會(huì)影響受體功能，GPCR激酶(GRKs)或β-arrestins在第三細(xì)胞質(zhì)環(huán)和/或C末端尾部的磷酸化可能參與受體脫敏。EDNRB在Asn59含有糖基化位點(diǎn)，但似乎不影響配體結(jié)合[10]。EDNRB對(duì)EDN1、EDN2和EDN3這三個(gè)配體都有很高且相似的親和力。雖然EDNRB可以結(jié)合這三種內(nèi)皮素，但對(duì)EDN3和EDNRB人和小鼠突變體的相似表型的觀察表明，EDN3是EDNRB的主要生理配體[12]。EDNRB與其配體之間的相互作用面積較大，這就很好地解釋了EDNs的異常高的親和力。EDNs結(jié)合誘導(dǎo)受體的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致效應(yīng)器的激活以及內(nèi)化，EDNRB內(nèi)化的作用是導(dǎo)致受體和配體的降解[9]。

2 EDNRB基因?qū)ι窠?jīng)嵴發(fā)育的調(diào)控作用

神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells，NCC）是胚胎發(fā)生早期，起源于神經(jīng)管背側(cè)的多能遷移細(xì)胞。學(xué)術(shù)界，根據(jù)NC細(xì)胞在前后胚軸上的初始位置，已經(jīng)確定了四個(gè)NC細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞在發(fā)育過程中聚集在胚胎的各個(gè)區(qū)域，并參與不同組織和器官的形成。根據(jù)類別和局部模式信號(hào)，NC細(xì)胞可以分化成多種譜系，包括黑素細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和各種結(jié)締組織，包括顱面骨骼的骨和軟骨，以及心臟近端流出道的平滑肌、外周神經(jīng)系統(tǒng)的一些神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，以及腸神經(jīng)系統(tǒng)的所有神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[9]。

大量的研究已經(jīng)證實(shí)內(nèi)皮素介導(dǎo)的信號(hào)在神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞系的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在脊椎動(dòng)物中，EDNRB首先在神經(jīng)管的背端表達(dá)，然后在NCC的背腹側(cè)和背側(cè)通路上表達(dá)[12]。Shin等[11]在1999年建立了一種能誘導(dǎo)表達(dá)EDNRB的小鼠。證明EDNRB信號(hào)通路在E10和E12.5小鼠胚胎中，對(duì)于黑素細(xì)胞和腸道神經(jīng)母細(xì)胞前體的起始和正確遷移至關(guān)重要。此外該信號(hào)通路對(duì)小鼠黑素細(xì)胞的存活、增殖和/或遷移起到關(guān)鍵調(diào)控作用，但對(duì)于遷移前增殖或能否決定遷移并非必要條件。此外，靶向敲除小鼠EDNRB基因?qū)嶒?yàn)同樣證實(shí)EDNRB在黑素細(xì)胞和腸道發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[12]。

3 EDNRB基因突變與Waardenburg綜合征的聯(lián)系

1951年，Waardenburg的研究結(jié)果發(fā)表在《美國人類遺傳學(xué)雜志》上，定義了現(xiàn)在被命名的I型Waardenburg綜合征[13]。WS是一種常見的綜合性耳聾，其特征是皮膚、頭發(fā)、眼睛和耳蝸血管紋中缺乏NCC衍生的黑素細(xì)胞[11]。

WS2主要表現(xiàn)為先天性感音神經(jīng)性聾和色素異常，直到1971年，Arias[13]才發(fā)現(xiàn)了Waardenburg綜合征的這一獨(dú)立分支，他將其命名為II型。WS2診斷的臨床標(biāo)準(zhǔn)至少描述為以下兩種：先天性感音神經(jīng)性聾、白額、虹膜完全或節(jié)段性異色、發(fā)育不良的藍(lán)眼、早期灰化和一級(jí)親屬受累[14]。WS4又稱Waardenburg—Shah綜合征或Waardenburg—Hirschsprung病，其主要特征為患者常伴先天性巨結(jié)腸或胃腸道閉鎖，部分WS4病例可出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，包括周圍神經(jīng)病變、智力遲鈍、小腦共濟(jì)失調(diào)和四肢痙攣[2]。迄今為止，大約5%的WS2和25-35%的WS4病例報(bào)告了EDNRB和/或EDN3突變[9]。

Doubaj等[15]報(bào)告了一個(gè)3個(gè)月大的摩洛哥女孩，其患病類型為WS4型?；颊哂?個(gè)表親在嬰兒期死亡，癥狀相同。Sanger測序的分子分析表明，EDNRB基因的外顯子6中發(fā)現(xiàn)了一種純合子錯(cuò)義突變c.1133A>G(P.Asn378Ser)，這一變化導(dǎo)致了天冬酰胺-378殘基被絲氨酸殘基所取代，從而導(dǎo)致胺基取代羥基，引起疾病的發(fā)生。Loupe等[16]的研究發(fā)現(xiàn)患者在RPS6KA3的第289密碼子發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的2 bp缺失(c.865_866delCA)，導(dǎo)致RSK2的框架移位和過早終止，使整個(gè)EDNRB基因的雜合缺失，導(dǎo)致父親、一個(gè)兒子和兩個(gè)女兒患有WS4。Sangkhathat等[17]的研究發(fā)現(xiàn)EDNRB基因在外顯子2的第196密碼子檢測到一個(gè)純合錯(cuò)義突變(Ser196Asn)，即該密碼子的第二個(gè)核苷酸發(fā)生的變化可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸天冬酰胺取代絲氨酸從而引發(fā)WS4。Syrris等[18]用標(biāo)準(zhǔn)的DNA突變分析和測序技術(shù)篩選了一個(gè)結(jié)合WS-HSCR表型的家族，以了解EDNRB位點(diǎn)的突變，其在密碼子253(CGA→TGA，Arg→STOP)上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的無義突變。這種突變導(dǎo)致EDNRB在第3外顯子的翻譯過早結(jié)束，并預(yù)測它會(huì)產(chǎn)生一個(gè)截短的非功能的EDNRB從而導(dǎo)致WS4。Ohtani等[19]研究了WS4小鼠，是模擬人類WS4的動(dòng)物模型，在此研究中，作者檢測了WS4小鼠Ednrb基因的基因組序列，發(fā)現(xiàn)該基因有598bp的缺失。被刪除的區(qū)域包含外顯子2的整個(gè)區(qū)域和外顯子3的5'端部分，并且兩側(cè)是反向重復(fù)序列，這被認(rèn)為是觸發(fā)刪除的原因。因此作者認(rèn)為Ednrb基因的缺失是WS4小鼠表型突變的主要原因。Matsushima等[20]報(bào)道了另一種WS4小鼠模型，由于外顯子2和3的缺失，它們的Ednrb缺乏編碼Ednrb跨膜結(jié)構(gòu)域的318個(gè)核苷酸。內(nèi)皮素3及其受體之間的相互作用是黑素細(xì)胞和奧爾巴赫叢細(xì)胞正常分化和發(fā)育所必需的。所以該文獻(xiàn)的結(jié)論是，這里缺失的相互作用導(dǎo)致了這些細(xì)胞的缺乏，進(jìn)而導(dǎo)致了WS4小鼠的色素沉著異常、耳聾和巨結(jié)腸。

Somashekar等[21]在攜帶純合突變的先證者中觀察到EDNRB的另一新的突變類型c.673G>A[p.（Gly225Ser）]，患者表現(xiàn)為WS2的特征且無先天性巨結(jié)腸表征。Issa等[14]篩選了49例疑似WS2診斷的EDNRB突變或缺失患者，先前發(fā)現(xiàn)MITF和SOX10突變陰性。在這個(gè)系列中，作者在EDNRB中發(fā)現(xiàn)了四個(gè)新的雜合突變，且在主要數(shù)據(jù)庫中均未見報(bào)道。在家系2中，作者發(fā)現(xiàn)c.50T>c變異導(dǎo)致信號(hào)肽中的p.Leu17Pro改變，可以通過SIFT（有害，得分：0.03）和 MutationTaster軟件（致病，p：0.607）來預(yù)測，而不能通過PolyPhen-2軟件（良性，得分：0.332）來預(yù)測。在家系3中，作者發(fā)現(xiàn)c.467C>G變異導(dǎo)致第二跨膜結(jié)構(gòu)域的p.Pro156Arg改變，這三個(gè)預(yù)測軟件均判斷為“高致病性”（SIFT有害，得分：0；MutationTaster：致病，p：1；PolyPhen-2：損傷，得分：0.999）。在家系4中，一個(gè)內(nèi)含子變異c.484-5T>G，被預(yù)測改變外顯子2上游的剪接受體位點(diǎn)。最后，在家系5中發(fā)現(xiàn)的變異，c.678G>A，被預(yù)測截?cái)嗟鞍踪|(zhì)（p.Trp226*）。

通常來說EDNRB突變導(dǎo)致WS2或者WS4，但隨著研究的深入，越來越多證據(jù)表明EDNRB突變同樣與WS其余的類型有關(guān)聯(lián)。Cheng等[4]的研究表明，EDNRB基因變異在一個(gè)患有WS1的中國家庭中被發(fā)現(xiàn)。按照WS的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，19歲男孩，其姐及一名旁系親屬被確診。先證者EDNRB基因外顯子2編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義雜合突變。在先證者患病的旁系親屬和姐姐身上也發(fā)現(xiàn)了同樣的突變。隨后的研究證實(shí)EDNRB中的c.469A>G雜合突變可能致具有病性。這是中國WS1患者中首次報(bào)道EDNRB突變?yōu)闈撛诘闹虏⊥蛔?。Morimoto等[22]的研究發(fā)現(xiàn)一列先證者EDNRB基因中有一個(gè)純合錯(cuò)義突變(p.R319W)而導(dǎo)致的WS1。p.R319W突變EDNRB的模型顯示該區(qū)域帶正電荷的表面積減少，這可能降低EDNRB與G蛋白的結(jié)合能力，并導(dǎo)致WS表型下的異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

4 發(fā)病機(jī)制

目前較為認(rèn)可的WS發(fā)病機(jī)制有兩種學(xué)說：單倍體劑量不足學(xué)說和顯性負(fù)效應(yīng)學(xué)說，但二者只能解釋部分WS發(fā)病機(jī)制。其中單倍體劑量不足學(xué)說認(rèn)為基因雜合突變中，兩個(gè)等位基因中的一個(gè)突變基因（無義突變、移碼突變和錯(cuò)義突變）導(dǎo)致其所編碼的蛋白質(zhì)失去正常功能或保留部分功能，另一個(gè)野生型基因編碼的蛋白質(zhì)的量不能達(dá)到兩個(gè)正常等位基因編碼的蛋白質(zhì)行使正常功能所需生物量的閾值，從而造成突變基因編碼的蛋白質(zhì)不能發(fā)揮正常的生理功能。不同個(gè)體癥狀嚴(yán)重程度的差異可能是由于殘留的正常野生蛋白量的不同以及不同個(gè)體不同器官中黑色素細(xì)胞發(fā)育所需野生蛋白量不同所致。EDNRB基因突變可因?yàn)閱伪扼w劑量不足效應(yīng)導(dǎo)致WS。顯性負(fù)效應(yīng)學(xué)說主要認(rèn)為，在兩個(gè)等位基因中如果一個(gè)基因突變，另一個(gè)基因保持野生型，即使突變的基因完全失去功能，理論上這一對(duì)等位基因仍應(yīng)保留50%功能。但某些情況下突變的蛋白質(zhì)不僅自身不能發(fā)揮正常生理功能，還使正常蛋白質(zhì)也不能發(fā)揮功能，這種蛋白質(zhì)相互作用中的干擾現(xiàn)象稱為顯性負(fù)效應(yīng)。EDNRB基因突變同樣存在因顯性負(fù)效應(yīng)抑制野生蛋白功能最終導(dǎo)致WS的可能性[23,24]。

綜上，EDNRB基因的一些突變導(dǎo)致蛋白表達(dá)的下降、蛋白質(zhì)相互作用的干擾和ETBR功能的喪失，繼而影響黑素細(xì)胞的增殖和分化。黑素細(xì)胞被認(rèn)為是血管紋的中間細(xì)胞，該細(xì)胞發(fā)育不良或減少，將會(huì)影響耳蝸血管紋分泌內(nèi)淋巴的功能，進(jìn)而引起聽力損失從而引起WS。

5 展望

經(jīng)過學(xué)者多年的研究，WS的分子遺傳背景得到了極大的豐富。盡管目前發(fā)現(xiàn)的EDNRB突變數(shù)量不斷增加，但對(duì)EDNRB突變導(dǎo)致WS的發(fā)病機(jī)制尚不明確。從神經(jīng)嵴發(fā)育到黑素細(xì)胞發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，EDNRB突變?cè)谶@個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的具體調(diào)控作用以及在調(diào)控中與其他蛋白的相互作用仍不明確。在WS發(fā)病中遺傳背景、基因修飾、環(huán)境因素等因素可能同樣具有重要意義，這些為今后研究WS發(fā)病機(jī)制提供了更多的潛在思路和研究方向。

目前人工耳蝸的植入是治療耳聾的一種較為普遍的手段，關(guān)于WS患者人工耳蝸植入效果的報(bào)道不多，盡管大部分現(xiàn)有報(bào)道表明術(shù)后效果良好，與其他耳聾無明顯差別，但仍有一些研究認(rèn)為部分WS患者術(shù)后效果不佳[25]。因此深入研究WS的發(fā)病機(jī)制，為徹底解決WS臨床治療難題奠定必要理論基礎(chǔ)。