劉輝敏 田瑤 貝承麗 傅滿姣

終止全球結核病流行的關鍵在于控制傳染源、切斷傳播途徑。研發(fā)高敏感度和高特異度的檢測技術及試劑以對活動性肺結核進行早診斷、早治療，對降低結核病的發(fā)病率極為重要。病原學陽性是診斷活動性肺結核的金標準[1]。痰抗酸桿菌涂片簡單、有效，但痰標本的質量難以保證、陽性率低，且無法有效區(qū)分結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)與非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)[2]。MTB培養(yǎng)可有效提高病原學陽性率，但周期長，易延誤診治[3]。分子生物學檢測可有效提高活動性肺結核患者痰液病原學的檢出率，臨床應用廣泛[4]。通過基于氣管鏡的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)聯(lián)合分子生物學檢測、肺組織活檢，以及超聲內鏡引導下的經支氣管針吸活檢(endobronchial ultrasound-transbronchial needle aspitation，EBUS-TBNA)等檢測技術獲取深部組織和分泌物亦可有效提高檢出率[5]，但費用昂貴且為有創(chuàng)操作，大部分患者難以接受。

為提高活動性肺結核診斷的準確率，尋找病原學依據極為重要，但我國存在大量病原學陰性(抗酸染色、核酸檢測、培養(yǎng)等方法無法檢出MTB)的活動性肺結核患者，缺乏便捷、準確的檢測技術及明確的診斷標準，使得該類患者難以確診[6]。我國《肺結核活動性判斷規(guī)范及臨床應用專家共識》指出，對于病原學陰性的肺結核活動性判定，應從以下方面綜合考慮：咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、乏力、盜汗、發(fā)熱、食欲減退等臨床表現；提示活動性結核病的典型肺部影像學表現；免疫學檢測中結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)和γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)陽性提示結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)也具有一定的參考價值[7]。我國《WS 288—2017 肺結核診斷》標準提出：排除肺部其他疾病后，免疫學檢查中TST中度陽性或強陽性、IGRA陽性、MTB抗體陽性3項中滿足任意一項，以及具有典型肺部結核病影像學表現，即可臨床診斷為結核病[1]。對于病原學依據不足的活動性肺結核患者，免疫學檢測具有取材方便、價格低廉、快速、敏感的優(yōu)勢，具有非常重要的臨床應用價值，應用前景廣泛。

一、細胞免疫與細胞因子檢測

1.TST：TST將結核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)注射到受試者體內，通過人體的免疫反應，觀察其是否出現遲發(fā)型超敏反應，以判斷是否感染過MTB[8]。我國人群普遍接種了卡介苗(bacille Calmette-Guérin，BCG)。PPD與BCG和NTM之間存在交叉反應，檢測特異度較低，假陽性率高；對免疫受損人群的檢測敏感度不足；并且，其結果通過人為觀察得到，主觀性強。因此，TST陽性結果僅能提示MTB感染，對于臨床判斷活動性肺結核意義不大[9]。

2.IGRA：IGRA是一種以細胞免疫反應為基礎的免疫學診斷方法，臨床應用較廣泛。MTB基因組學的發(fā)展促進了此檢測方法的發(fā)展。BCG菌株及大多數非致病性分枝桿菌基因組中均缺乏MTB的RD1區(qū)；RD1區(qū)僅存在于結核分枝桿菌復合群及少數致病性分枝桿菌基因組中。MTB的RD1區(qū)上Rv3874編碼的培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein-10，CFP-10)和早期分泌抗原靶蛋白6(early secreting antigen target-6，ESAT-6)是MTB的RD1區(qū)基因片段編碼的兩種主要抗原[10-11]，與機體內Th1細胞結合，可引起強烈的、特異性的T細胞反應，導致T細胞分泌大量γ-干擾素(IFN-γ)?；谠撛黹_展的結核感染T細胞斑點試驗(T-cell spot of tuberculosis，T-SPOT.TB)，對MTB抗原敏感的效應T細胞進行定量檢測，具有較高的敏感度和特異度，但檢測結果陽性僅表示體內存在針對MTB的效應T細胞，無法有效鑒別活動性肺結核與LTBI[12-14]。國內研究顯示，IGRA檢測活動性結核病的敏感度為53%～98%，特異度為60%～90% (或以上)，差異較大[15]。但多數報道中IGRA檢測的敏感度和特異度均超過70%；在病原學陰性的活動性結核病中，IGRA檢測的總體敏感度為80%，總體特異度為79%，均高于TST，可作為缺乏病原學依據的肺結核活動性判斷的輔助手段[16-17]。

王婷等[18]發(fā)現T-SPOT.TB結果陽性對診斷活動性結核病的敏感度為91.0%，特異度為75.2%。Wang等[19]對T-SPOT.TB結果進行深度分析，發(fā)現結核特異性抗原(TB-specific antigen，TBAg)與植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)斑點數的比值可有效診斷活動性結核病和LTBI，以0.234為臨界值時，其敏感度為69.5%，特異度為94.1%，受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)為0.881，效果優(yōu)于T-SPOT.TB；以0.236為臨界值時，TBAg/PHA比值鑒別結核球與孤立性肺結節(jié)或腫瘤的敏感度為80.6%，特異度為93.3%，AUC為0.921；以0.129為臨界值時，TBAg/PHA比值對鑒別結核球和其他良性疾病的敏感度為85.1%，特異度為90.0%，AUC為0.909。此外，該比值對肺外結核亦有一定的診斷價值，同時該比值在抗結核治療中出現明顯下降，提示該指標在有效區(qū)分活動性結核病與LTBI的同時能對抗結核治療療效進行監(jiān)測[20-21]。Luo等[22]對T-SPOT.TB檢測結果中ESAT-6斑點形成細胞平均斑點大小聯(lián)合改良TBAg/PHA比值鑒別活動性結核病和LTBI進行研究，活動性結核病患者ESAT-6斑點形成細胞平均斑點大小和改良TBAg/PHA比值均明顯高于LTBI者，建立二者的聯(lián)合診斷模型，以0.46為臨界值時，該模型鑒別活動性結核病和LTBI的AUC值高達0.959，敏感度為90.12%，特異度為91.02%。

3.細胞因子檢測：結核病患者體內免疫機制以細胞免疫為主，對于控制、殺滅MTB，巨噬細胞發(fā)揮了重要作用。巨噬細胞吞噬MTB后，產生白細胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α和轉化生長因子(TGF)-β等一系列的細胞因子，各細胞因子又可反向調節(jié)巨噬細胞抗菌活性。目前認為，Th1型細胞因子(IFN-γ、IL-12 等)促進免疫應答；Th2型細胞因子(IL-4、IL-10)抑制免疫應答。血漿中一些特異性的細胞因子和趨化因子能夠作為診斷活動性結核病的免疫學標志物，多種細胞因子的組合可以區(qū)分機體內MTB的不同感染狀態(tài)。

IFN-γ是其中最關鍵的細胞因子，目前臨床上應用廣泛。對于活動性結核病患者，結核病初診時及抗結核治療期間和治療后的IFN-γ水平的變化存在爭議。有研究認為無明顯差異，也有研究顯示可出現下降或陰轉，亦有部分患者呈現持續(xù)上升的趨勢[23-25]。隨著IL-2、單核細胞趨化蛋白2(MCP-2)、干擾素誘導蛋白10(IP-10)等細胞因子的發(fā)現，一些IFN-γ水平較低、T-SPOT.TB陰性的活動性結核病患者得到早期診斷和治療[26]。一項Meta分析表明，IP-10診斷活動性結核病的AUC為0.88，診斷LTBI的敏感度和特異度分別為73%和83%[27]。Luo等[28]發(fā)現使用嗜酸粒細胞激活趨化因子、CCL22和MCP-1等3種細胞因子的組合能有效區(qū)分活動性結核病和LTBI，其敏感度為87.76%，特異度為91.84%，AUC為0.94。IFN-γ和IL-2分泌量與結核病的臨床疾病狀態(tài)有關，活動性肺結核患者T細胞以分泌IFN-γ和IL-2為主，IL-2可作為鑒別活動性結核病和LTBI的潛在生物標志物。余艷艷等[29]對381份臨床樣本(256例結核病患者、69例非結核病患者、56名健康人群)進行研究，其中結核病組排除陳舊性肺結核及LTBI者，發(fā)現IFN-γ和IL-2雙因子聯(lián)合檢測在活動性結核病診斷中的雙陽敏感度為75.12%，特異度為94%，可有效提高結核病的檢出率。隨著技術不斷進步，未來研究應關注多種細胞因子聯(lián)合檢測，以提高診斷的準確率。這可能是鑒別活動性肺結核和LTBI及判斷結核病治療療效的關鍵。

二、體液免疫檢測

體液免疫檢測技術是診斷結核病的重要方法，臨床應用較為普遍。多采用受試者血清標本進行檢測，通過酶聯(lián)免疫法、免疫膠體金滲濾法等來檢測受試者血清中的抗原、抗體、細胞因子水平，具有簡單、高效、便捷等優(yōu)點。但其檢測的敏感度和特異度則會根據檢測方法及抗原抗體的變化而改變。

1.MTB抗原檢測：利用抗原抗體反應測定人體內抗原濃度判斷機體是否感染MTB。目前的MTB抗原有：PPD、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)、ESAT-6、CFP-10、抗原85(Ag85)復合物、38 kD抗原、31 kD抗原等。當人體感染MTB后，抗原刺激機體產生抗體需要經過一段時間，因此抗原檢測具有早期診斷意義。

LAM是構成分枝桿菌細胞壁中脂多糖的主要部分，具有高免疫原性，可在尿液標本中被檢出，具有高效、便捷、低廉、無創(chuàng)、簡單、可床旁開展等優(yōu)點[30-31]。對其檢測具有較髙的準確度，可用于診斷CD4+T淋巴細胞<100個/μl或重癥HIV患者是否并發(fā)結核病。有研究評估痰液LAM檢測作為抗結核療效監(jiān)測的指標，亦有一定的優(yōu)勢[32-33]。Rv3873、Rv3615c是MTB感染進展為活動性結核病的早期標志物。孫衛(wèi)國等[34]發(fā)現Rv2660c只能與活動性結核病(包括病原學陽性和陰性)患者血清發(fā)生抗原抗體反應，出現一條明顯的雜交條帶；LTBI者和健康對照者血清則無該條帶出現。劉永亮[35]發(fā)現Rv0183能夠刺激全血分泌IL-6，并且在活動性結核病患者中的表達水平明顯高于LTBI人群和健康人群。唐潔等[36]利用Mtb-HAg-10k特異性誘導人外周血單個核細胞(PBMC)產生TNF-α和IFN-γ，發(fā)現活動性結核病患者PBMC中IFN-γ產生細胞數明顯低于LTBI者，可有助于區(qū)分活動性結核病和LTBI。

某些抗原在MTB休眠狀態(tài)下特異性表達，如DosR蛋白抗原。Shi等[37]從25個DosR蛋白抗原中篩選出一組包含9個DosR蛋白抗原的組合，為HspX(Rv2031c)、Hrp1(Rv2626c)、DevR(Rv3133c)、Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2628、Rv3129和Rv3131，該組合預測活動性結核病的敏感度為10/10，預測LTBI的敏感度為9/10，特異度均為100%(14/14)，整體檢測正確率為97.1%。

MTB抗原檢測可避免因機體免疫應答低下導致的假陰性，作為MTB存在的直接證據，對診斷活動性肺結核具有重要價值。但MTB抗原種類及數目繁多，如何合理選擇抗原來診斷活動性肺結核目前尚無定論。單一抗原進行診斷的效果欠佳，多種抗原的聯(lián)合檢測及相關抗原蛋白的融合表達為今后MTB抗原診斷的發(fā)展提供了新思路。

2.MTB抗體檢測：利用抗原抗體反應測定人體內抗體滴度判斷機體是否感染MTB。MTB抗體檢測對活動性結核病的診斷具有一定的價值，特別是對痰涂片/痰培養(yǎng)陰性、少/無痰及肺外結核者[38]。但人體血液中抗體為多克隆抗體，MTB抗原檢測時易出現交叉反應，準確性偏低；重癥結核病、HIV感染等免疫力低下者體內的MTB抗原難以刺激機體產生足量的抗體，致使敏感度較低，存在假陰性可能；初愈結核病患者體內MTB抗體濃度較高，存在假陽性。活動性肺結核患者體液中MTB抗體水平較高，隨著治療進展，MTB抗體水平降低，抗體檢測對結核病患者療效判斷有一定價值。

三、新技術與思路

以免疫學檢測為基礎的蛋白芯片技術是將不同的蛋白質分子按預先設置的排列順序有序地固定在載體表面做成微陣列檢測芯片，用標記了特定熒光物質的抗原或抗體與其反應，利用熒光掃描儀等檢測芯片上各點的熒光強度，再對各樣本中的蛋白進行分析。其具有所需樣本量少、高通量、高敏感度、方便、快速等優(yōu)點[39]。Cao等[40]采用含有4262種抗原的蛋白質芯片篩選可鑒別LTBI與活動性結核病患者的血清生物標志物，ROC分析顯示，Rv2031c、Rv1408、Rv2421c等3種抗原的AUC分別為0.8520、0.8152、0.7970。蛋白芯片技術是近年來新興的一種方法，也存在無法區(qū)分既往感染及現癥感染的不足，對活動性肺結核的診斷意義有必要進一步研究。

MTB入侵宿主體內，宿主為抵抗會啟動一系列免疫應答反應，稱為結核宿主反應。利用轉錄組學的方法獲取活動性結核病患者全血細胞轉錄組圖譜，篩選出可用于診斷活動性結核病的多個基因標志物，是診斷活動性肺結核的突破點[41]。Warsinske等[42]將Sweeney團隊篩選出的在活動性結核病患者中表達水平與其他患者明顯不同的3個基因(GBP5、DUSP3、KLF3)整合，創(chuàng)建了一個3-基因結核分數(3-gene TB score)，可有效鑒別活動性結核病與LTBI。將來基于轉化醫(yī)學的新型宿主免疫學診斷標志物的尋找也是鑒別肺結核活動性的關鍵，為結核病免疫學診斷提供了新的思路。

四、總結

目前，對病原學陰性活動性肺結核的診斷仍是臨床診療中的熱點及難點問題。對于痰液病原學陰性的患者，推薦使用支氣管鏡下肺泡灌洗、肺活檢等手段獲取病理學和病原學依據，如仍無法明確，則需通過臨床癥狀、影像學、免疫學、診斷性抗結核治療綜合判斷。

對于肺結核活動性的判斷仍有許多問題需要解決，包括研究高敏感度和特異度的檢測手段，發(fā)掘高效準確的生物標志物，建立科學的診斷流程。多種抗原及細胞因子聯(lián)合檢測，對于判斷肺結核活動性有一定的價值，結核宿主免疫反應相互作用機制的深入研究也為臨床診斷活動性肺結核提供了新方法。但目前仍缺乏統(tǒng)一的標準，結合新技術新方法，多種標志物聯(lián)合診斷提高對活動性肺結核診斷的敏感度和特異度是當前診斷方法發(fā)展的趨勢，可能是未來鑒別肺結核活動性和LTBI，以及預測結核病發(fā)病風險，解決結核病患者精準治療和精準停藥等臨床問題的關鍵。