陳泉潤(rùn)，蔣玉芹，劉 鵬，謝蒂立

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都610054；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院老年心血管科，四川 成都610072)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種以脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)為特征的慢性血管炎癥性疾病[1]。在AS形成過(guò)程中，循環(huán)中的單核細(xì)胞到內(nèi)膜后分化成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞再攝取大量改性脂蛋白，如氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)后，轉(zhuǎn)化為富脂泡沫細(xì)胞，這是早期AS病變的標(biāo)志[2]。miRNAs是長(zhǎng)度約為22 bp的小型內(nèi)源性非編碼RNA分子，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和代謝等生理病理過(guò)程[3,4]。Yébenes等[5]研究表明，抑制血管中miR-217可保護(hù)血管功能，緩解AS。Wang等[6]的研究表明，miR-224-3p在AS中低表達(dá)，miR-224-3p上調(diào)可減輕小鼠AS。腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員14(TNFSF14)在多種免疫細(xì)胞中高表達(dá)[7]。Yuan等[8]報(bào)道TNFSF14在冠心病患者中表達(dá)增加，并促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝。本課題擬通過(guò)研究miR224-3p和TNFSF14的相互作用及在老年AS患者、動(dòng)物和細(xì)胞模型中的表達(dá)，確定其在AS中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑和儀器 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基和12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)和ox-LDL購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich；所有miRNA相關(guān)試劑，對(duì)照模擬物(miR-NC)、miR-224-3p模擬物(miR-224-3p)、對(duì)照抑制劑(in NC)、miR-224-3p抑制劑(in miR-224-3p)及對(duì)照miRNA agomir(ago-NC)、miR-224-3p agomir(ago-miR-224-3p)、對(duì)照 antago-miRNA、antago-miR-30a-5p及過(guò)表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA)、過(guò)表達(dá)TNFSF14質(zhì)粒(TNFSF14)和TNFSF14雙熒光素酶質(zhì)粒均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；TRIzol試劑、青霉素-鏈霉素、RIPA緩沖液、BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒和BeyoECL Plus購(gòu)自上海碧云天公司；雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng) (北京Promega)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自德國(guó)Fermentas；SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒(大連寶生物公司)；一抗GAPDH、TNFSF14、清道夫受體(SR-A)、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1(ACAT1 )、脂肪生成基因(ACS)、PPARα和CPT-1及相應(yīng)二抗購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司；甘油三酯(TG酶法)測(cè)試盒和總膽固醇(TCH酶法)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。ABI 7900HT 快速實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems)；Tanon 5500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)；Olympus BX50倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)。

1.1.2臨床樣本 收集2019年6月至2020年6月在四川省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科確診的老年(年齡65～79歲)AS患者31例和健康志愿者18例血液標(biāo)本(作為對(duì)照組)，用qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡的方法比較其中miR-224-3p和TNFSF14表達(dá)水平的變化。該研究得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，參與者已全部簽署知情同意書(shū)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只8周齡雄性ApoE -/- 背景的C57BL/6小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2021-0011，并在12 h光照/黑暗循環(huán)下飼養(yǎng)在無(wú)菌環(huán)境中，可以自由獲取食物和水，保持恒定的濕度 (55±5)% 和溫度 (23±1)℃。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 THP-1單核細(xì)胞(TIB-202，ATCC)在補(bǔ)充有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中于37 ℃和5% CO2的加濕環(huán)境下培養(yǎng)。為了誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，用100 nmol/LPMA處理細(xì)胞24 h。然后，將巨噬細(xì)胞與50 μg/ml ox-LDL孵育48 h，形成泡沫細(xì)胞。根據(jù)制造商的方案，使用Lipofectamine 3000 試劑將上述相關(guān)試劑轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞，分別為miR-NC組、miR-224-3p組、in NC組、in miR-224-3p組、pcDNA組和TNFSF14組，對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率及miR-224-3p和TNFSF14的靶向關(guān)系；隨后分組為對(duì)照組、ox-LDL組、ox-LDL+miR-224-3p組、ox-LDL+TNFSF14組和ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p組，以檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-224-3p和TNFSF14對(duì)ox-LDL處理的THP-1細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的影響。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá) 使用TRIzol 試劑從THP-1細(xì)胞中分離總RNA。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將來(lái)自每個(gè)樣品的約5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。然后，以cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，程序?yàn)?5 ℃ 3 min；90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。使用2 -ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：miR-224-3p 正向引物：5′-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3′，反向引物：5′-AAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3′；U6 正向引物：5′-CTGGTAGGGTGCTCGCTTCGGCAG-3′，反向引物：5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；TNFSF14正向引物: 5′-CGTGAGACCTTCGCTCTTGTAT-3′，反向引物: 5′-CCCTCAGTGTTTGTGGTGGAT-3′；GAPDH正向引物: 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3′。反向引物: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡 將細(xì)胞或小鼠主動(dòng)脈組織用RIPA緩沖液進(jìn)行裂解。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量。隨后，取等量蛋白質(zhì)通過(guò) SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后用相應(yīng)抗體在4 ℃避光孵育過(guò)夜。然后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗在37 ℃孵育1 h。使用BeyoECL Plus觀察蛋白質(zhì)條帶，使用Image J軟件確定光密度值。

1.2.4雙熒光素酶報(bào)告基因分析 在線數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-224-3p與TNFSF14之間的結(jié)合位點(diǎn)。THP-1細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種在96孔板中。將TNFSF14 3′UTR WT或TNFSF14 3′UTR MUT和 miR-224-3p模擬物或miR-NC通過(guò)Lipofectamine 3000試劑共轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞，48 h后使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)評(píng)估相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.5油紅O染色細(xì)胞 內(nèi)脂滴經(jīng)體外轉(zhuǎn)染48 h后，THP-1細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞在4%多聚甲醛溶液中固定5 min，然后用油紅O工作溶液在37 ℃ 避光染色5 min，并用60%異丙醇脫色10 s。在倒置顯微鏡下(×200)對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.2.6細(xì)胞內(nèi)TG和TC檢測(cè) 按照甘油三酯(TG酶法)測(cè)試盒和總膽固醇(TCH酶法)測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定THP-1細(xì)胞內(nèi)TG和TC水平。

1.2.7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[9]將小鼠隨機(jī)分為HFD組、HFD+ago-NC組和HFD+ago-miR-224-3p組，每組10只。給予小鼠高脂飲食(HFD)(18%脂肪和1.25%膽固醇)12周以誘導(dǎo)AS，同時(shí)通過(guò)尾靜脈分別注射PBS、ago-NC、ago-miR-224-3p，每3天一次。

1.2.8組織取材 12周后，小鼠禁食過(guò)夜并在清晨通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進(jìn)行麻醉。摘除眼球，取血后離心分離血清，-80 ℃保存。使用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)血清中TC和TG水平。然后打開(kāi)胸腹腔，4%多聚甲醛灌流左心室30 min，仔細(xì)解剖心臟上部和近端主動(dòng)脈，將主動(dòng)脈縱向展開(kāi)，用油紅O染色，然后拍照，用Image-Pro Plus 7.0軟件測(cè)定主動(dòng)脈表面被油紅O染色的病灶面積百分比。隨后，提取小鼠主動(dòng)脈總RNA，按照1.2.2 qRT-PCR操作檢測(cè)基因表達(dá)。

1.2.9HE染色顯示主動(dòng)脈竇病變情況 取各組小鼠主動(dòng)脈竇處組織樣本，用O.C.T包埋劑包埋，石蠟切片脫蠟脫水后，蘇木素染色5 min，再將玻片置于伊紅染液中染色2 min，流水沖洗。常規(guī)脫水，透明，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.10油紅O染色主動(dòng)脈竇 主動(dòng)脈竇組織經(jīng)冰凍切片后，油紅O染色10 min，50%異丙醇分化30 s，蘇木素復(fù)染5 min，1%鹽酸酒精分色1s，封片后光鏡下觀察并拍照。用Image-pro Plus 7.0軟件檢測(cè)主動(dòng)脈竇油紅O染色面積。

1.2.11Masson染色主動(dòng)脈竇 組織經(jīng)冰凍切片后，蘇木素染色6 min，氨水返藍(lán)，麗春紅品紅染色液染色3 min，磷鉬酸分化3 min，苯胺藍(lán)染色2 min，分化水洗，脫水，透明，封片。鏡下觀察并拍照。膠原纖維染成藍(lán)色，肌組織染成紅色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用 GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均表示為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)未配對(duì)的Student′st檢驗(yàn)比較兩組之間的差異，單因素方差分析用于比較多組之間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-224-3p和TNFSF14在體內(nèi)和體外的表達(dá)與對(duì)照組(1.00 ± 0.02)比較，miR-224-3p在AS患者血清(0.41 ± 0.03)和ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中(0.38 ± 0.04)的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，TNFSF14蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-224-3p和TNFSF14在體內(nèi)和體外的表達(dá) a：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)血清中TNFSF14蛋白的表達(dá)；b：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)THP-1細(xì)胞中TNFSF14蛋白的表達(dá)

2.2 miR224-3p與TNFSF14的靶向關(guān)系TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)miR-224-3p與TNFSF14的3′UTR序列結(jié)合(圖2)。TNFSF14 3′UTR WT與miR-224-3p共轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞明顯降低相對(duì)熒光活性(P<0.05)，見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，miR-224-3p組TNFSF14蛋白表達(dá)下調(diào)，inmiR-224-3p組TNFSF14蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖2 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-224-3p與TNFSF14結(jié)合的序列

表1 熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-224-3p和TNFSF14的靶向關(guān)系

表2 各組THP-1細(xì)胞中miR-224-3p和TNFSF14表達(dá)水平的變化

2.3 過(guò)表達(dá)miR-224-3p和TNFSF14后THP-1細(xì)胞中脂質(zhì)含量和脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的變化對(duì)照組、pcDNA組和TNFSF14組中TNFSF14 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.00 ± 0.04)、(0.97± 0.06)和(4.32 ± 0.27)，與對(duì)照組相比，TNFSF14組TNFSF14 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。與對(duì)照組相比，ox-LDL刺激后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累顯著增多；與ox-LDL組比較，ox-LDL+TNFSF14組細(xì)胞內(nèi)脂脂質(zhì)積累顯著增多，而ox-LDL+miR-224-3p組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累明顯減少，見(jiàn)圖3和表3。 ox-LDL組細(xì)胞中SR-A、ACAT1和ACS的表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表達(dá)顯著下調(diào)；與ox-LDL組比較，ox-LDL+TNFSF14組細(xì)胞中SR-A、ACAT1和ACS的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，ox-LDL+miR-224-3p組細(xì)胞中各蛋白表達(dá)情況與之相反。 與ox-LDL+TNFSF14組比較，ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累顯著減少(P<0.05)，SR-A、ACAT1和ACS的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

圖3 THP-1細(xì)胞中脂質(zhì)累積圖像 a：對(duì)照組；b：ox-LDL組；c：ox-LDL+miR-224-3p組；d：ox-LDL+TNFSF14組；e：ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p組(油紅O染色，×200)

表3 各組THP-1細(xì)胞中的TC和TG含量變化

2.4 過(guò)表達(dá)miR-224-3p對(duì)ApoE-/-小鼠中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響HFD組、HFD+ago-NC組、HFD+ago-miR-224-3p組小鼠主動(dòng)脈中miR-224-3p表達(dá)量分別為(1.00 ± 0.03)、(0.98 ± 0.05)和(3.73 ± 0.18)，TNFSF14蛋白表達(dá)量分別為(0.54 ± 0.04)、(0.51 ± 0.06)和(0.22 ± 0.03)。與HFD組相比，HFD+miR-224-3p組小鼠主動(dòng)脈中miR-224-3p的表達(dá)顯著增加，TNFSF14蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05，圖4a)，TC和TG水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表5。SR-A、ACAT1和ACS的表達(dá)明顯下調(diào)，PPARα和CPT-1的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖4b。

表4 各組THP-1細(xì)胞中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白水平變化的比較

2.5 過(guò)表達(dá)miR-224-3p對(duì)ApoE-/-小鼠AS的影響與HFD組相比，HFD+ago-miR-224-3p組主動(dòng)脈弓區(qū)域AS病變的數(shù)量、大小以及病變面積明顯減少(P<0.05)。HE、油紅O和Masson染色顯示HFD+ago-miR-224-3p組病灶面積及脂質(zhì)沉積顯著減少，膠原蛋白含量顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表6和圖5。

表5 各組小鼠血清中TC和TG的含量變化

圖4 過(guò)表達(dá)miR-224-3p對(duì)ApoE-/-小鼠中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響a：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)TNFSF14蛋白表達(dá)；b：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)(1：HFD組；2：HFD+ago-NC組；3.HFD+ago-miR-224-3p組)

表6 各組ApoE-/-小鼠AS病變比較

圖5 過(guò)表達(dá)miR-224-3p對(duì)ApoE-/-小鼠AS的影響a：HFD喂養(yǎng)的Apo E -/-小鼠通過(guò)尾靜脈注射PBS、ago-NC和ago-miR-224-3p處理后，立體顯微鏡下主動(dòng)脈弓斑塊(黃色箭頭)(40×)；b：Apo E -/-小鼠主動(dòng)脈大體標(biāo)本(油紅O染色)；c：Apo E -/-小鼠主動(dòng)脈根部冷凍切片(HE、油紅O或Masson染色(1：HFD組；2：HFD+ago-NC組；3.HFD+ago-miR-224-3p組)

3 討論

最近的研究表明miR-224-3p在人類心血管疾病中發(fā)揮重要作用。例如，Dharma等[10]發(fā)現(xiàn)miR-224-3p與STEMI患者血管生成后冠脈微血管阻塞有關(guān)。Wang等[6]報(bào)道HDAC1通過(guò)去乙?；鰪?qiáng)miR-224-3p的表達(dá)，進(jìn)而減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生抗AS作用。本研究觀察到在AS患者中，miR-244-3p低表達(dá)，而TNFSF14高表達(dá)。THP-1細(xì)胞已被廣泛用于脂質(zhì)代謝相關(guān)的研究[11]。本研究結(jié)果顯示在ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中miR-244-3p 和TNFSF14表達(dá)結(jié)果與體內(nèi)一致。miR-244-3p直接與TNFSF14 3′UTR結(jié)合來(lái)抑制TNFSF14的表達(dá)。

研究表明巨噬細(xì)胞在炎癥和脂質(zhì)沉積中起著關(guān)鍵作用，而炎癥和脂質(zhì)沉積是AS斑塊形成和破裂的關(guān)鍵觸發(fā)因素[12,13]。本研究結(jié)果顯示，TNFSF14過(guò)表達(dá)顯著增加了ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)的脂滴，升高了細(xì)胞內(nèi)TC和TG水平，并顯著降低了脂肪分解基因的水平，增加了脂肪生成基因的表達(dá)。重要的是，miR-224-3p通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)TNFSF14的表達(dá)減輕了巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚。富含膽固醇的脂蛋白(包括ox-LDL)主要通過(guò)細(xì)胞表面的如SR-A1被攝取到THP-1巨噬細(xì)胞中，并在泡沫細(xì)胞的形成中起重要作用[14]。ACAT-1是細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)和AS的關(guān)鍵酶[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-224-3p在高脂飲食喂養(yǎng)ApoE敲除小鼠體內(nèi)明顯下調(diào)TNFSF14的表達(dá)，并降低了血清TC和TG含量，同時(shí)顯著增加了脂肪分解基因的水平，降低了脂肪生成基因的表達(dá)，與細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，HE、油紅O和Masson染色顯示miR-224-3p顯著減少病灶面積并抑制脂質(zhì)沉積，并顯著增加膠原蛋白含量。因此，miR-224-3p通過(guò)降低TNFSF14的表達(dá)抑制脂質(zhì)積聚，進(jìn)而抑制ApoE敲除小鼠AS病變的發(fā)展。