楊 泳，王新池，尹統(tǒng)統(tǒng)，宋 超,，孟順龍，范立民

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214081)

羅非魚(yú)是我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2020年淡水養(yǎng)殖羅非魚(yú)產(chǎn)量約為166萬(wàn)t。在池塘養(yǎng)殖羅非魚(yú),養(yǎng)殖密度達(dá)17 400 kg/hm2時(shí)，每生產(chǎn)1 kg魚(yú)需消耗水21 000 L[1-2]，產(chǎn)量的大量增長(zhǎng)常伴隨著養(yǎng)殖水環(huán)境的破壞。水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)生水環(huán)境污染的原因主要是微生物、投喂飼料和水產(chǎn)品代謝產(chǎn)生的水體污染。在集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)快速發(fā)展的當(dāng)下，高密度養(yǎng)殖產(chǎn)生了大量代謝物及高蛋白飼料殘餌沉積，極易引起養(yǎng)殖水質(zhì)惡化，影響?zhàn)B殖生物正常的攝食、生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致疾病和死亡[3]。

糖蜜作為制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，具有易獲取、成本低、用途廣的特點(diǎn)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，糖蜜常用在肥水、防病、降低溶解氮、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等方面[10]，以實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)健康養(yǎng)殖，因此其非常符合作為補(bǔ)充碳源的要求[11]。本實(shí)驗(yàn)利用Biolog-ECO法和檢測(cè)常規(guī)水質(zhì)理化指標(biāo)的變化，分析研究低劑量糖蜜添加對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)及水體微生物代謝多樣性的影響，以期了解低劑量糖蜜添加對(duì)吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響，為日后低劑量糖蜜在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用20個(gè)圓形聚乙烯養(yǎng)殖桶，容積為1 000 L。實(shí)驗(yàn)前養(yǎng)殖桶經(jīng)過(guò)消毒后，加入約800 L自來(lái)水，使用增氧泵曝氣7 d。曝氣后加入約1 L塘底淤泥，提供微生物源。之后開(kāi)始為期90 d的羅非魚(yú)養(yǎng)殖，實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖水體溫度控制在20～30 ℃，整個(gè)養(yǎng)殖周期不換水。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間需保證供氧充足，每個(gè)養(yǎng)殖桶均插入兩根輸氧管，連接曝氣石和增氧泵。實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖水體溶解氧濃度維持在(7.0±1.3) mg/L。

選取同批次、同等規(guī)格的吉富羅非魚(yú)(GIFTOreochromisniloticus)，由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心屺亭基地提供，每個(gè)養(yǎng)殖桶放養(yǎng)20尾魚(yú)苗，平均體質(zhì)量為(3.89±1.33) g，養(yǎng)殖過(guò)程中進(jìn)行相同頻率的投喂，前期投喂量為體質(zhì)量的1%，后期隨著魚(yú)體增長(zhǎng)，調(diào)整為體質(zhì)量的2%。按占投喂飼料質(zhì)量的百分比設(shè)置4個(gè)不同的添加糖蜜梯度，分為對(duì)照組(C)、10%糖蜜實(shí)驗(yàn)組(10S)、20%糖蜜實(shí)驗(yàn)組(20S)和40%糖蜜實(shí)驗(yàn)組(40S)，每組處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。前期養(yǎng)殖時(shí)間為60 d，待魚(yú)體質(zhì)量達(dá)到(10.00±0.13) g時(shí)(本實(shí)驗(yàn)中為7月31日)，開(kāi)始添加投喂糖蜜。添加過(guò)程為先用適量養(yǎng)殖水溶解糖蜜，然后進(jìn)行全桶均勻潑灑，添加時(shí)間與投喂飼料時(shí)間相同(09:00和16:00)。糖蜜添加量根據(jù)日投喂飼料量調(diào)整。基礎(chǔ)飼料使用天邦食品股份有限公司產(chǎn)精養(yǎng)淡水魚(yú)1號(hào)配合飼料。

1.2 樣品采集與檢測(cè)

1.2.1 水質(zhì)檢測(cè)

自7月31日起，每隔7 d從養(yǎng)殖桶水面以下30 cm處采集水樣，檢測(cè)水質(zhì)指標(biāo)包括pH、溶解氧(DO)、總氮(TN)、氨氮(NH3-N)、亞硝酸鹽(NO2-N)、硝酸鹽(NO3-N)、總磷(TP)和化學(xué)需氧量(CODMn)。采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定TP濃度，過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定TN，納氏試劑分光光度法測(cè)定NH3-N，N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定NO3-N、NO2-N，高錳酸鉀-草酸鈉滴定法測(cè)CODMn質(zhì)量濃度。pH及DO采用玻璃電極法測(cè)定[12]。

1.2.2 水體微生物代謝多樣性檢測(cè)

9月10日，用250 mL采樣瓶取養(yǎng)殖桶水面下30 cm處養(yǎng)殖水體，沉淀2 h。沉淀完成后取上清液，用8孔加樣器吸取150 μL加至Biolog-ECO微平板中，設(shè)置光照培養(yǎng)箱28 ℃恒溫避光培養(yǎng)，每12 h使用Beckman Beachmark plus酶標(biāo)儀(新振儀器設(shè)備有限公司，上海)讀板一次，共讀取14次Blank590和Blank750波長(zhǎng)的數(shù)值，選擇96 h的數(shù)據(jù)來(lái)分析不同樣品中微生物對(duì)不同碳源利用效率的顯著性差異，并進(jìn)行微生物多樣性指數(shù)及微生物群落主成分分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

讀取Blank590和Blank750波長(zhǎng)數(shù)值后，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平均每孔顏色變化率(AWCD)，分析96 h時(shí)的數(shù)據(jù)，探究微生物對(duì)6大類(lèi)碳源利用效率的顯著性差異，進(jìn)行主成分分析(PCA)并計(jì)算各樣點(diǎn)的Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和豐富度指數(shù)。運(yùn)用Microsoft office軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Graphpad Prism 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

AWCD、Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和豐富度指數(shù)計(jì)算公式如下：

AWCD=∑(Ci-R)/n

(1)

AWCD代表微生物群落利用碳源的整體能力。其中Ci為微平板31個(gè)碳源孔的吸光度值；R為對(duì)照孔的吸光度值；n為碳源的總數(shù)，在Biolog-ECO板中，n=31。

Shannon指數(shù)：H′=∑PilnPi

(2)

H′反映物種豐富度信息。Pi表示第i個(gè)孔的吸光度值與所有非對(duì)照孔吸光度值的比值(下同)。

Simpson指數(shù)：D=1-∑Pi

(3)

D表示優(yōu)勢(shì)度指數(shù)，衡量樣本中優(yōu)勢(shì)種群信息。

(4)

U反映微生物群落均一性的變量。ni表示第i孔的相對(duì)吸光度值。

豐富度指數(shù)為被利用碳源的總數(shù)，即Ci-R的值大于0.25的孔個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低劑量糖蜜添加對(duì)吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

7月31日首次投喂糖蜜后的兩次采樣中，實(shí)驗(yàn)組NH3-N濃度均高于對(duì)照組(圖1-A)。8月24日后，實(shí)驗(yàn)組NH3-N濃度逐漸低于C組且40S組NH3-N濃度顯著低于C組。此外，自9月7日采樣起，各組NH3-N濃度隨糖蜜投喂量增加而減少，特別是40S組與C組間有顯著差異。

養(yǎng)殖過(guò)程中水體里TN、TP的含量同樣呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，整體看變化幅度不大。8月24日后(圖1-B)，各實(shí)驗(yàn)組濃度開(kāi)始低于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異。CODMn在養(yǎng)殖水體中的變化則是呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)，并且糖蜜添加組含量始終高于C組。

圖1 低劑量糖蜜添加對(duì)吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

2.2 低劑量糖蜜添加對(duì)吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體微生物代謝多樣性影響

AWCD主要作用是通過(guò)一段時(shí)間內(nèi)微平板孔內(nèi)顏色的變化來(lái)反映微生物利用碳源的能力。由圖2可知，不同濃度糖蜜投喂下養(yǎng)殖水體中的微生物對(duì)碳源整體的利用效率均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。0～24 h區(qū)間內(nèi)，微生物利用碳源程度較低，AWCD值上升緩慢，C組的微生物活性略高于糖蜜添加組的微生物活性。24～96 h區(qū)間內(nèi)，各組微生物AWCD值快速上升，微生物利用碳源效率達(dá)到高峰。對(duì)不同組ECO微平板96 h AWCD值進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，C組與各糖蜜添加組中的微生物AWCD值均無(wú)顯著性差異?？傮w趨勢(shì)上看，低劑量糖蜜添加組的微生物AWCD值變化幅度稍大于C組，不同組之間微生物AWCD大小排序?yàn)?0S組>10S組>40S組>C組。表明低劑量糖蜜添加組中微生物對(duì)不同碳源的利用能力稍強(qiáng)一些。

圖2 吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體微生物對(duì)碳源利用情況

2.3 不同低劑量糖蜜添加下養(yǎng)殖水體微生物對(duì)不同碳源的利用效率

圖3是在低劑量糖蜜投喂量的情況下，微生物對(duì)不同種類(lèi)碳源的利用率情況?？傮w上，不同糖蜜投喂?jié)舛认吗B(yǎng)殖水體微生物對(duì)6類(lèi)不同碳源的利用效率隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。對(duì)聚合糖類(lèi)碳源的利用，在96 h后表現(xiàn)為緩慢下降的狀態(tài)；對(duì)氨基酸類(lèi)碳源，20S組與40S組108 h后明顯高于C組及10S組；對(duì)酯類(lèi)碳源的利用則是40S組明顯高于低濃度糖蜜添加組及C組；對(duì)醇類(lèi)碳源的利用效率整體最低，并且差異極??；對(duì)胺類(lèi)及酸類(lèi)碳源的利用強(qiáng)度則是10S組明顯高于C、20S和40S組。整體上看，不同糖蜜添加組之間對(duì)醇類(lèi)碳源利用效率最低，對(duì)氨基酸類(lèi)、酯類(lèi)碳源利用效率較高。10S組對(duì)胺類(lèi)碳源的利用強(qiáng)度顯著高于C組和其他糖蜜實(shí)驗(yàn)組。對(duì)其他各類(lèi)碳源的利用，各組之間無(wú)顯著性差異。

圖3 不同濃度糖蜜下吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體微生物對(duì)碳源利用

2.4 不同低劑量糖蜜添加下吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體微生物多樣性指數(shù)

微生物多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、McIntosh指數(shù)和豐富度指數(shù)等組成。表1顯示除10S和40S組的McIntosh指數(shù)較對(duì)照組顯著升高以外，其他各實(shí)驗(yàn)組各指數(shù)均與對(duì)照組差異不顯著。

表1 不同濃度糖蜜下吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體微生物多樣性指數(shù)

2.5 不同微生物群落對(duì)不同碳源的利用情況

為研究不同糖蜜投喂?jié)舛认录涣_非魚(yú)養(yǎng)殖水體微生物群落碳代謝的影響，選取Biolog-ECO微平板培養(yǎng)96 h作為分析時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行主成分分析(PCA)，提取3個(gè)主成份，第一主成分(PC1)為48.74%，第二主成分(PC2)為23.93%，第三主成分(PC3)為12.17%，三個(gè)主成分綜合了全部碳源84.84%的信息，提取前2個(gè)主成分作主成分分析圖。其中兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá)72.67%。由圖4-3可知C組主要分布在第I、IV象限，10S組主要分布在第I、II象限，20S組主要分布在第II象限，40S組主要分布在III、IV象限。10S組與20S組的三個(gè)點(diǎn)均在第II象限，說(shuō)明兩組之間相似度高。C組與各實(shí)驗(yàn)組之間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明相似度不高，具有一定差異性。反映出低劑量糖蜜添加條件下養(yǎng)殖水體微生物群落有不同的群落結(jié)構(gòu)，具有不同的碳代謝特點(diǎn)。

圖4 不同微生物群落主成分分析

3 討論

3.1 低劑量糖蜜添加對(duì)吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)殖過(guò)程中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組一樣水體里TN、TP的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，整體看變化幅度不大。但糖蜜投喂28 d后，各實(shí)驗(yàn)組濃度開(kāi)始低于對(duì)照組，但實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著差異，顯示出糖蜜對(duì)去除水體中TN、TP雖有一定的效果，但并不顯著,這與湯佩武[19]利用生物絮團(tuán)調(diào)控水質(zhì)的研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)TN的去除率，隨糖蜜投喂量的增加而增加。對(duì)TP的去除率則是20S組最好并且與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，其他組間并未產(chǎn)生明顯差異。TP的去除大部分是依靠水體中浮游植物消耗，隨著糖蜜添加量的增加，養(yǎng)殖水體中浮游動(dòng)植物數(shù)量也相應(yīng)增加，最終TP濃度得到一定降低[20]。40S組并未與對(duì)照組產(chǎn)生明顯差異的原因可能與投喂糖蜜后產(chǎn)生的大量異養(yǎng)菌對(duì)養(yǎng)殖水體中游離態(tài)磷的利用率不高有關(guān)[21]。

CODMn在養(yǎng)殖水體中的變化則是呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)，并且糖蜜添加組含量始終高于對(duì)照組。CODMn含量的大小與水中有機(jī)和無(wú)機(jī)可氧化物質(zhì)數(shù)量息息相關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組CODMn含量均高于對(duì)照組的原因可能是投喂糖蜜后，糖蜜本身作為有機(jī)物添加后必然帶來(lái)CODMn的升高。并且隨著C/N升高，大量異養(yǎng)菌繁殖，與水體中殘餌、原生動(dòng)物等產(chǎn)生大量生物絮團(tuán)，從而造成耗氧量的增加。但是過(guò)高的CODMn可能表明養(yǎng)殖水體中生物排泄物、殘餌與浮游動(dòng)植物殘骸等顆粒懸浮物過(guò)多，養(yǎng)殖者需及時(shí)吸污排出以保證良好的養(yǎng)殖水環(huán)境[22]。

如今，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始嘗試用微生態(tài)制劑與糖蜜配合使用改善養(yǎng)殖水質(zhì)。如張曉陽(yáng)等[23]在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中將芽孢桿菌與糖蜜配合使用，與僅使用糖蜜相比，產(chǎn)量提高了19.13%，餌料系數(shù)降低了22%。廖藝樞[24]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究了乳酸菌與糖蜜配合投喂對(duì)吉富羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響，發(fā)現(xiàn)其存活率、增重率顯著高于對(duì)照組。未來(lái)，將糖蜜與其他微生態(tài)制劑配合使用處理養(yǎng)殖廢水可能會(huì)成為一個(gè)發(fā)展方向。

3.2 低劑量糖蜜添加對(duì)吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體微生物代謝多樣性的影響

Blolog-ECO微平板法通過(guò)平均每孔顏色變化率數(shù)值的高低反映微生物群落利用31種碳源的整體偏好[25]。通過(guò)不同組數(shù)值之間的差異，可以深入分析各組間微生物群落的變化趨勢(shì)，并且可以計(jì)算不同環(huán)境影響下微生物的多樣性指數(shù)[26]。楊鶯鶯等[27]利用Biolog-ECO技術(shù)對(duì)池塘水環(huán)境的微生物群落進(jìn)行分析，結(jié)果池塘水環(huán)境中微生物對(duì)氨基酸類(lèi)、酸類(lèi)和糖類(lèi)碳源利用率較高。董媛媛等[28]通過(guò)在羅非魚(yú)養(yǎng)殖中利用生物絮團(tuán)進(jìn)行餌料替代實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體微生物對(duì)脂類(lèi)和胺類(lèi)碳源利用率較高，對(duì)酸類(lèi)利用率最低。兩人實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大不同，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)環(huán)境的不同影響了微生物對(duì)碳源的利用。

在本次實(shí)驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組AWCD值平穩(wěn)后數(shù)值均高于C組(圖2)，表明實(shí)驗(yàn)組微生物群落對(duì)碳源利用水平高于C組。張哲等[29]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，微生物群落結(jié)構(gòu)隨著添加碳源的變化也會(huì)發(fā)生一定的變化。根源在于不同的微生物對(duì)不同的碳源利用效率不同。因此加入不同的碳源會(huì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)造成一定影響。本實(shí)驗(yàn)以糖蜜作為添加碳源，且實(shí)驗(yàn)全程溫度適宜、pH穩(wěn)定、溶解氧充足，微生物能夠有良好的生長(zhǎng)繁殖環(huán)境，最終各組數(shù)值產(chǎn)生一定差異，這與于皓等[30]的研究結(jié)果相吻合。進(jìn)一步對(duì)本實(shí)驗(yàn)中微生物對(duì)六大類(lèi)碳源的利用能力分析發(fā)現(xiàn)，最主要的利用碳源類(lèi)型為氨基酸類(lèi)和酯類(lèi)，其次是酸類(lèi)和聚合糖類(lèi)，最后是醇類(lèi)和胺類(lèi)(圖3)，這與楊鶯鶯等[27]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相吻合。

通過(guò)對(duì)各組進(jìn)行微生物多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和豐富度指數(shù)之間均無(wú)明顯差異，而McIntosh指數(shù)，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組微生物多樣性與對(duì)照組有明顯差異。通過(guò)對(duì)各組養(yǎng)殖水體培養(yǎng)96 h時(shí)微生物碳源代謝進(jìn)行主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)各組散點(diǎn)圖分布區(qū)域有一定差異，相關(guān)研究表明，不同條件下微生物群落有不一樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此產(chǎn)生了不同的碳源代謝特征[31]。這與本實(shí)驗(yàn)在不同濃度糖蜜投喂后散點(diǎn)圖分布比較分散相吻合。 雖然單憑Biolog-ECO微平板技術(shù)很難完整地反映生態(tài)環(huán)境微生物多樣性的變化規(guī)律，但通過(guò)運(yùn)用BIolog-ECO技術(shù)對(duì)低劑量糖蜜投喂?jié)舛葪l件下養(yǎng)殖水體的微生物群落進(jìn)行分析，對(duì)運(yùn)用低劑量糖蜜進(jìn)行水產(chǎn)健康養(yǎng)殖仍具有一定借鑒意義[32]。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，低劑量糖蜜添加可有效降低吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體水質(zhì)中無(wú)機(jī)氮的濃度，并且隨著糖蜜投喂量的增加，無(wú)機(jī)氮濃度降低趨勢(shì)更加明顯。糖蜜添加對(duì)TN和TP的去除也有一定效果。同時(shí)，投喂低劑量糖蜜明顯增強(qiáng)了微生物對(duì)碳源的利用能力，微生物代謝能力增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組微生物活性明顯高于對(duì)照組。綜合考慮成本等因素后，推薦20%糖蜜添加為適合的使用劑量。