劉 鑫，溫 彬,3，馬騰飛，繆 琳，高建忠,3，陳再忠,3

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306)

七彩神仙魚(Symphysodonaequifasciatus)隸屬于鱸形目(Perciformes)慈鯛科(Cichlidae)盤麗魚屬(Symphysodon)，原產(chǎn)于亞馬遜河流域，因其體色艷麗，條紋多樣等特征，被譽為“觀賞魚之王”[1]。該物種具有獨特的親代撫育行為，即仔魚孵化后的四周內(nèi)以親本體表分泌的粘液為營養(yǎng)和免疫來源[2-3]。BUCKLEY等[4]發(fā)現(xiàn)七彩神仙魚粘液中含有大量營養(yǎng)和非營養(yǎng)因子，包括免疫球蛋白、激素和必需離子。免疫球蛋白M(IgM)在親魚產(chǎn)卵后逐漸增加，在幼魚達到自由游泳階段時達到峰值，然后下降到最初的水平，這種變化類似于哺乳動物在母乳喂養(yǎng)期間為子代提供的被動免疫[5-6]。

免疫球蛋白超家族(IgSF)由至少編碼一個免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域的基因組成，其成員具多種細胞功能，如細胞表面抗原受體、細胞粘附分子和細胞因子受體等[7]。連接黏附分子(JAMs)是IgSF成員，其中，JAM-A分子參與細胞旁通透性、白細胞跨內(nèi)皮遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血小板活化等生物過程[8-9]。DU等[10]克隆了草魚(Ctenopharyngodonidella)Gcjam-a，發(fā)現(xiàn)Gcjam-a可能是呼腸孤病毒的受體，在病原體免疫防御中發(fā)揮作用。cd22屬唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(Siglecs)，也是IgSF成員，主要表達于B細胞，調(diào)節(jié)其存活、增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗體的產(chǎn)生[11]。本實驗組前期對七彩神仙魚育幼期皮膚轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),jam-a和cd22基因表達分別在育幼期間和育幼結(jié)束后顯著上調(diào)，暗示著二者可能參與了親子的免疫防御，且扮演不同的角色。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，是淡水養(yǎng)殖魚類常見的病原菌[12-13]，氣單胞菌屬會導(dǎo)致七彩神仙魚患腸炎病[14]。本實驗選取嗜水氣單胞菌[15]為感染模型，從七彩神仙魚皮膚中克隆獲得了jam-a和cd22，并通過熒光定量PCR法分析了其在組織中的表達量，以及細菌刺激后各組織中的表達模式，以期初步了解jam-a和cd22在七彩神仙魚免疫系統(tǒng)中可能的作用，為豐富IgSF分子在硬骨魚類中的免疫功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康的七彩神仙魚(體長10～13 cm，體質(zhì)量80～100 g)取自上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)1周[(28±0.5) ℃，pH 7.8±0.5，充氧]。嗜水氣單胞菌菌株來自上海海洋大學(xué)病原庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 七彩神仙魚總RNA提取與cDNA的合成

七彩神仙魚暫養(yǎng)后，選6尾健康的七彩神仙魚，解剖收集肝臟、心臟、脾臟、頭腎、皮膚、腸道、肌肉、鰓、腦和性腺，共10個組織，使用TRIzol(Invitrogen)提取各組織中的總RNA，1%瓊脂凝膠電泳測定RNA完整性，其濃度和純度用分光光度計測定。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa)說明書合成cDNA。

1.2.2sajam-a和sacd22基因克隆

根據(jù)前期七彩神仙魚皮膚轉(zhuǎn)錄組獲得jam-a和cd22 cDNA部分序列，利用Primer 5設(shè)計開放閱讀框(open reading frame,ORF)特異性引物(表1)，分別用于克隆驗證上述基因的ORF序列。以七彩神仙魚皮膚中的cDNA為模板，利用PCR方法及上述引物對sajam-a和sacd22進行擴增。擴增體系25 μL：cDNA 1 μL，正反向引物各1 μL，金牌 Mix green(TsingKe)22 μL。反應(yīng)條件：98 ℃，2 min；98 ℃，10 s，56 ℃，10 s，72 ℃，10 s，34個循環(huán)；72 ℃，1 min。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂凝膠電泳測定并切膠回收，送至上海生工生物公司進行測序。

1.2.3sajam-a和sacd22基因生物信息學(xué)分析

使用NCBI上的ORF Finder查找sajam-a和sacd22的ORF區(qū)，并獲得相應(yīng)的氨基酸序列；應(yīng)用ExPASy工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測等電點(pI)及分子質(zhì)量(Mw)； SignalP 4.1和TMHMM 2.0分別預(yù)測信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域；SMART分析蛋白結(jié)構(gòu)域；Blast程序搜索與其他物種的jam-a和cd22基因同源性分析；使用Clustal-X和MEGA 5.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4sajam-a和sacd22基因的組織表達分析

根據(jù)sajam-a和sacd22的ORF區(qū)設(shè)計熒光定量PCR特異性引物(表1)。以七彩神仙魚各組織的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因，利用熒光定量RT-PCR的方法測定各組織中sajam-a和sacd22的表達模式。反應(yīng)體系20 μL：2×T5 Fast qPCR Mix(TsingKe) 10 μL，cDNA 模板1.6 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，1 min；95 ℃，10 s，56 ℃，5 s，72 ℃,10 s，40個循環(huán)；95 ℃，5 s；65 ℃，5 s；95 ℃，15 s。采用2-ΔΔCt法計算sajam-a和sacd22在組織中的相對表達量。

表1 引物信息

1.2.5sajam-a和sacd22基因免疫刺激后的表達變化

將健康的七彩神仙魚分為2組，每組36尾魚，分別飼養(yǎng)于已曝氣的水中。實驗組腹腔注射1x107cfu/mL的菌液(2 mL/尾)，對照組注射等量的PBS緩沖液。在注射后的0、6、12、24、48、72 h后，分別從兩組隨機各取6尾魚，對其進行解剖取樣，主要取樣組織為皮膚、腸道、頭腎和脾臟。提取各組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用qRT-PCR測定免疫刺激后各組織不同時間點sajam-a和sacd22的表達模式。反應(yīng)體系、程序及表達量計算方法同上述組織表達。采用SPSS軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 sajam-a和sacd22的克隆及序列分析

七彩神仙魚sajam-a和sacd22的ORF序列長度分別為903 bp和1 032 bp(圖1)，分別編碼300和343個氨基酸(aa)。sajam-a預(yù)測蛋白理論Mw為32.51 kDa，PI為8.84，其N基端存在1個信號肽(aa 1～20)，隨后是1個Ig(aa 26～126)和1個Ig C2結(jié)構(gòu)域(aa 128～213)，羥基末端是1個跨膜結(jié)構(gòu)域(aa 236～257)(圖1A)。sacd22蛋白理論Mw為38.12 kDa，PI為8.82，其氨基酸序列存在1個信號肽(aa 1～18)，2個Ig結(jié)構(gòu)域(aa 26～128 134～202)，1個Ig C2結(jié)構(gòu)域(aa 219～278)和1個跨膜結(jié)構(gòu)域(aa 297～319)(圖1B)。

圖1 七彩神仙魚sajam-a(A)和sacd22(B)的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 sajam-a和sacd22氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

BLAST比對發(fā)現(xiàn)，魚類中jam-a氨基酸序列有較高的相似度(51.83% ～ 93.00%)，sajam-a的氨基酸序列與尼加拉瓜湖始麗魚(Archocentruscentrarchus)的相似度最高，為93.00%；尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)次之，為71.76%(圖2A)。cd22氨基酸序列在魚類中也有較高的相似度(71.72%～92.71%)，sacd22的氨基酸序列與尼加拉瓜湖始麗魚的相似度最高，為92.71%(圖2B)。各物種jam-a和cd22氨基酸序列構(gòu)成的系統(tǒng)進化樹表明，哺乳類和魚類分別單獨成簇，七彩神仙魚jam-a和cd22均與尼加拉瓜湖始麗魚的進化距離最近(圖3)。

圖2 jam-a(A)和cd22(B)氨基酸的多重序列比對

圖3 基于NJ法構(gòu)建的jam-a(A)和cd22(B)系統(tǒng)進化樹

2.3 sajam-a和sacd22的組織表達模式

如圖4所示，sajam-a和sacd22在健康七彩神仙魚的10個組織中都有表達，并存在顯著的組織差異性。sajam-a在鰓中表達量最高，其次是肝臟、頭腎、腸道和皮膚，在肌肉中表達量最低(圖4A)。sacd22在脾臟和頭腎表達量較高，同樣在肌肉中幾乎不表達(圖4B)。

圖4 sajam-a(A)和sacd22(B)在七彩神仙魚不同組織中的表達特征

2.4 sajam-a和sacd22基因免疫刺激的表達變化

嗜水氣單胞菌感染七彩神仙魚后，定量分析測定七彩神仙魚腸道、頭腎、皮膚和脾臟組織中jam-a和cd22的時序表達模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腸道、頭腎、皮膚和脾臟中，sajam-a的表達量均在6 h時顯著上升，且在腸道和頭腎中6 h達到峰值，分別為對照組的5.30倍和5.60倍，12 h開始降低(圖5A和B)；在皮膚和脾臟中12 h達到峰值，分別為對照組的7.05倍和8.57倍，在24 h降低，48 h達到最低值，72 h恢復(fù)正常水平(圖5C和D)。腸道和頭腎中，sacd22的表達量在6 h顯著上升，在頭腎中72 h達到峰值(圖6A和B)；脾臟組織sacd22的表達水平在48 h顯著上調(diào)，72 h達到峰值(圖6D)；皮膚組織sacd22的表達水平在12 h顯著上調(diào)，48 h達到峰值(圖6C)。

圖5 嗜水氣單胞菌感染后sajam-a在七彩神仙魚不同組織中(A-D)的表達分析

圖6 嗜水氣單胞菌感染后sacd22在七彩神仙魚不同組織中(A-D)的表達分析

3 討論

IgSF成員通過突變和選擇進化出大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)參與了細胞識別、粘附、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的過程，在特異性和非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[16-17]。本研究根據(jù)七彩神仙魚皮膚轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，克隆獲得sajam-a和sacd22。其推導(dǎo)的氨基酸序列均包含1個信號肽，表明其蛋白質(zhì)可能分泌到細胞外基質(zhì)中，作為細胞間信使行使功能[16]。另外，兩個基因均至少包含一個Ig結(jié)構(gòu)域，這也是證明其為IgSF成員的重要依據(jù)。序列比對顯示，sajam-a和sacd22的氨基酸序列均與同為慈鯛科的尼加拉瓜湖始麗魚同源性最高，這一結(jié)果證明了克隆得到的sajam-a和sacd22基因序列的準(zhǔn)確性。進化樹分為魚類和哺乳動物兩大支，jam-a和cd22氨基酸序列進化關(guān)系與動物本身的進化分類吻合，揭示jam-a和cd22在進化過程中的保守性。

組織測定表明sajam-a和sacd22在各組織中都有不同的表達模式，并存在顯著的組織差異性。其中，sajam-a在鰓中表達量最高，其次是肝臟、頭腎、腸道和皮膚。鰓是重要的免疫組織，可以與水生環(huán)境中的各種病原體相互作用，其免疫功能和結(jié)構(gòu)完整性是魚類正常生長和抗病能力所必需的[18]。腸道和皮膚存在著淋巴組織，包含著淋巴細胞、巨噬細胞等，是魚類重要的黏膜免疫組織，能抵御病原體的入侵[19]。頭腎和脾臟是硬骨魚中最大的淋巴組織和免疫活性組織，巨噬細胞較多，具有吞噬及捕獲抗原的功能[20]。草魚的Gcjam-a主要在鰓和腸道中表達，其次為腎和肝等免疫組織，結(jié)果與本研究相似[10]。在七彩神仙魚中，sacd22也在10個組織中廣泛表達，在脾臟和頭腎等免疫組織中表達量較高。sajam-a和sacd22在七彩神仙魚這些免疫相關(guān)組織中的高表達，表明其在機體免疫機制中發(fā)揮重要的作用。

嗜水氣單胞菌感染魚體后，sajam-a和sacd22的表達量在腸道、頭腎、脾臟和皮膚中均呈現(xiàn)顯著上調(diào)，但二者具有不同的表達模式。皮膚是機體免疫防御的第一道屏障，在皮膚中sajam-a迅速響應(yīng)，表達量6 h開始顯著上調(diào)，12 h達到峰值。同樣，sajam-a的表達量在另外3個組織中6 h均顯著上調(diào)，然后表達量逐漸下降，恢復(fù)到正常水平。而sacd22的表達量在皮膚中12 h開始上調(diào)，脾臟中48 h開始上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)sacd22在72 h內(nèi)維持較高的表達量。JAMs在細胞間接觸部位觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)的能力調(diào)節(jié)多種生物過程，包括白細胞滲出、緊密連接形成和維持、細胞旁通透性、細胞極化、屏障功能調(diào)節(jié)、細胞遷移和血小板活化的調(diào)節(jié)[9]。在哺乳動物中，已經(jīng)證實jam-a為輪狀病毒(Rotaviruses)[21]、貓杯狀病毒(Felinecalicivirus)[22]、呼腸孤病毒(Mammalianreovirus)[23]的受體。大量研究表明，病原刺激會影響jam-a基因的表達[24-25]。Siglecs是一類包含Ig結(jié)構(gòu)域的細胞表面受體，主要存在于脊椎動物的各種免疫細胞中，可以與含唾液酸的聚糖特異性結(jié)合，促進細胞粘附和細胞信號傳導(dǎo)[11]。CD22作為Siglecs家族的一員，可以調(diào)控B細胞受體信號傳導(dǎo)閾值，對B細胞的早期發(fā)育發(fā)揮重要的作用，且在小鼠中驗證了這一功能[26]。據(jù)報道，JAM-A可以通過細胞介導(dǎo)的防御反應(yīng)促進先天免疫[10]，而CD22通過調(diào)控B細胞信號傳導(dǎo)，活化B細胞促進體液免疫[11]，這可能是sajam-a和sacd22在七彩神仙魚感染病原菌后組織中表達模式不同的原因。七彩神仙魚免疫組織中sajam-a和sacd22的變化，表明了sajam-a和sacd22均參與了抗菌免疫反應(yīng)，推測在七彩神仙魚親代撫育階段，sajam-a和sacd22分別對親魚先天免疫和體液免疫反應(yīng)發(fā)揮了重要的作用，具體作用機制還需要進一步的研究。