劉 濤 白 浪 高永濤

膽囊癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1]，流行病學研究發(fā)現我國膽囊癌發(fā)病率占同期膽道疾病0.4%～3.8%，位列消化道腫瘤發(fā)病率第6位[2-3]。由于膽囊癌具有惡性程度高、易發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移及遠處轉移、放化療敏感性差等臨床生物學特性，膽囊癌患者總體預后較差，5年生存率不足5%[4-5]。對于晚期膽囊癌患者，姑息性放化療能減緩腫瘤進展、緩解疼痛、改善總體生存率，有結果顯示聯(lián)合放化療是能延長病人總體生存時間，然而目前對膽囊癌化療方案存在爭議[6]。吉西他濱(gemcitabine，GEM)聯(lián)合順鉑(cisplatinum，DDP)是進展期膽道腫瘤治療的首選化療方案[7]，然而大多數膽囊癌患者的癌細胞對GEM是耐藥的，因此對GEM耐藥機制探討成為近年來膽囊癌化療研究的熱點。槲皮素(quercetin)是從以槲皮類植物中提取出來的一種黃酮類化合物，化學名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，近幾年來，已有研究證實槲皮素對多種實體腫瘤具有抑制作用[8-9]，但對膽囊癌細胞的作用研究較少，本研究通過將槲皮素金屬配合物與膽囊癌GBC-SD細胞共培養(yǎng)，檢測細胞的增殖及侵襲能力的變化以及細胞內hENT-1表達變化，以期為膽囊癌GEM耐藥機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

膽囊癌細胞株GBC-SD購自中國科學院上海細胞所細胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液( Gibco 公司);0.25% 胰酶( Hyclone公司);侵襲小室( Sigma公司)、CCK-8 試劑盒(北京博奧森公司)、PCR引物序列由北京生物工程有限公司設計合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2，相對濕度95%的恒溫孵育箱中培養(yǎng)人膽囊癌GBC-SD細胞；將GBC-SD細胞按接種于96孔板中，按0、10、20、40、80、160 μmol/L的 Co(Que)2藥物濃度將細胞分為6組，CCK8法測定GBC-SD細胞的生長曲線，確定Co(Que)2的最佳實驗濃度，每組實驗重復3次。

將最佳試驗濃度Co(Que)2、GEM等不同組合與人膽囊癌GBC-SD細胞培養(yǎng)，細胞克隆形成實驗檢測對GBC-SD細胞增殖的影響；劃痕實驗和 Transwell體外侵襲實驗檢測細胞侵襲遷移能力的影響。

將最佳試驗濃度Co(Que)2、GEM等不同組合與人膽囊癌GBC-SD細胞培養(yǎng)，Trizol法提取各組細胞總RNA，RT-PCR法測量細胞內hENT-1 mRNA的相對表達，反應條件：95 ℃預變性 5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)，用 hENT-1/β-actin 的比值表示hENT-1 mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 槲皮素金屬配合物與膽囊癌GBC-SD細胞系共培養(yǎng)

將不同濃度Co(Que)2與膽囊癌GBC-SD細胞共培養(yǎng)24 h后，隨著濃度的增加，Co(Que)2對膽囊癌GBC-SD細胞抑制率亦增高，160 μmol/L的 Co(Que)2對GBC-SD細胞的抑制率達(83.5±15.8)%，與其他不同濃度抑制率有統(tǒng)計學差異(F=35.12，P<0.0001)(圖1A)。將50 μmol/L的Co(Que)2與GBC-SD細胞培養(yǎng)不同時間后，培養(yǎng)120 h后Co(Que)2對GBC-SD細胞的抑制率達(87.7±12.6)%，與其他組有統(tǒng)計學差異(F=25.44，P<0.0001)(圖1B)，表明Co(Que)2對GBC-SD細胞增殖抑制作用呈時間及濃度依賴性。

注：A為不同濃度Co(Que)2培養(yǎng)24 h；B為50 μmol/L培養(yǎng)不同時間。

2.2 Co(Que)2抑制GBC-SD細胞增殖、侵襲

將濃度為50 μmol/L的Co(Que)2與膽囊癌GBC-SD細胞共培養(yǎng)24 h后，細胞克隆形成實驗檢測對GBC-SD細胞增殖的影響，結果顯示Co(Que)2+GEM聯(lián)合培養(yǎng)后細胞克隆數目形成最少(114±16)，與其他組有統(tǒng)計學差異(F=20.06，P<0.0001)，Co(Que)2組細胞克隆數目(195±20)，高于正常對照組(t=32.18，P<0.0001)(圖2)。采用劃痕實驗、Transwell小室檢測共培養(yǎng)后膽囊癌GBC-SD細胞轉移和侵襲能力的變化，Co(Que)2+GEM組細胞遷移數目(95±16.7)低于NC組(158±31.7)和GEM組(128±27.4)，差異有統(tǒng)計學意義(F=15.34，P=0.0015)(圖3)。

圖2 細胞克隆形成實驗檢測Co(Que)2對GBC-SD細胞增殖的抑制作用

圖3 劃痕實驗和 Transwell體外侵襲實驗檢測Co(Que)2對GBC-SD細胞遷移、侵襲能力的抑制作用

2.3 Co(Que)2上調GBC-SD內hENT-1 mRNA的表達

將濃度為50 μmol/L的Co(Que)2與膽囊癌GBC-SD細胞共培養(yǎng)24 h后，RT-PCR檢測GBC-SD內hENT-1 mRNA的表達，Co(Que)2+GEM組 hENT-1 mRNA 的表達為(0.61±0.15)，明顯高于空白對照組(0.42±0.07)和GEM組(0.48±0.09)，差異有統(tǒng)計學意義(F=3.986，P=0.0471)。

3 討論

目前對膽囊癌化療方案存在爭議[10]。2010年，ValleJ等在新英格蘭雜發(fā)表文章，發(fā)現GEM聯(lián)合DDP組中位生存期(11.7個月)明顯高于GEM單藥組(8.1個月)[11]，從而確立GEM聯(lián)合DDP方案為進展期膽道腫瘤治療的首選化療方案。但多項Ⅱ期臨床試驗報道以GEM為主的化療方案對膽囊癌的客觀緩解率僅在20%～36%之間[12-13]，提示大多數膽囊癌患者的癌細胞對GEM是耐藥的，因此對GEM耐藥機制探討成為近年來膽囊癌化療研究的熱點。GEM是一種胞嘧啶核苷衍生物，在腫瘤細胞DNA合成期通過半胱氨酸天冬氨酸酶級聯(lián)放大系統(tǒng)誘導細胞凋亡[14-16]，然而親水性的GEM通過細胞膜的脂性結構極為困難，其主要通過hENT-1進入細胞內[17]，因此，hENT-1蛋白和mRNA表達水平被認為是預測 GEM臨床療效最具潛力的生物標志物[18]。

槲皮最早記載于唐朝蘇敬等奉敕于顯慶四年(公元659年)編撰的《唐本草》，槲皮素(Quercetin)是從以槲皮類植物中提取出來的一種黃酮類化合物，化學名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，近幾年來，已有研究證實槲皮素對多種實體腫瘤具有抑制作用，但對膽囊癌細胞的作用研究較少。

目前研究顯示槲皮素及其金屬配合物的抗腫瘤機制主要集中在以下幾個方面。①抑制端粒酶的活性：槲皮素能夠抑制端粒酶的活性，破壞其穩(wěn)定性，誘導細胞凋亡；②調控腫瘤的癌基因與抑癌基因：槲皮素在翻譯水平抑制突變型P53蛋白的表達，抑制c-myc、ras等癌基因及上調P21等抑癌基因的表達；③阻滯細胞周期：槲皮素能減少癌細胞DNA的復制,使細胞周期阻滯于G1期、G2/M期；④阻遏熱休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)：槲皮素可以在基因轉錄水平抑制HSP的表達，增加腫瘤細胞對放、化療的敏感性，誘導細胞凋亡；⑤抑制腫瘤新生血管的形成：槲皮素可能通過抑制基質MMP-2和MMP-9的活性來抑制腫瘤新生血管的生成，從而誘導腫瘤細胞凋亡、抑制轉移；⑥逆轉腫瘤多藥耐藥：槲皮素可以通過下調熱休克蛋白HSP70的表達和抑制P糖蛋白的功能，發(fā)揮逆轉多藥耐藥功能[19-22]。本研究通過將Co(Que)2與GBC-SD細胞共培養(yǎng)發(fā)現，Co(Que)2對GBC-SD細胞增殖抑制作用呈時間及濃度依賴性，而且能抑制GBC-SD細胞的侵襲與轉移，通過RT-PCR檢查細胞內hENT-1 mRNA表達，結果顯示Co(Que)2使GBC-SD細胞內hENT-1 mRNA表達上調，因此我們推測，Co(Que)2通過上調GBC-SD細胞內hENT-1 mRNA的表達，進而增強GEM對GBC-SD細胞的化療敏感性，進而抑制細胞增殖、轉移侵襲能力。

本研究結果表明，槲皮素金屬配合物能夠有效地抑制膽囊癌細胞的增殖、侵襲遷移，其機制主要通過上調hENT-1增強吉西他濱對膽囊癌細胞化療敏感性，為膽囊癌吉西他濱耐藥機制探討提供實驗基礎。