裴 磊 節(jié)陽華 胡 悅 朱 玲 王 寧

胰腺癌(pancreatic cancer)作為最為常見的消化道腫瘤，發(fā)病率連年上升，5年生存率僅9%[1-2]，其高死亡率與不典型的早期癥狀和極易發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移有關(guān)。近100年，腫瘤治療在靶向、免疫等方面日新月異，許多患者因此而受益，甚至得到根治，但仍有部分患者因就診晚，缺乏有效的治療方法，治療效果較差。目前國內(nèi)外醫(yī)學研究者展開了多項實驗，試圖獲得治療胰腺癌的新診治靶點。橋粒斑菲素蛋白3(Plakophilin 3,PKP3)可以影響細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞粘附，在腫瘤發(fā)生中起重要作用。PKP3蛋白已被證明在多種癌癥中發(fā)揮作用,如乳腺癌、下咽癌、胃癌、黑色素瘤及其他類型腫瘤，但目前尚無研究闡述PKP3在胰腺癌中的分布與其生物學功能。本研究通過生物信息學分析PKP3蛋白在不同組織、不同期別胰腺癌組織中的表達，與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系及其發(fā)揮的生物學功能，闡述其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 PKP3在胰腺癌中的表達及其對生存預(yù)后影響的分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn,GEPIA database)是目前我國在利用TCGA數(shù)據(jù)做可視化分析上,比較著名的一款在線工具。打開數(shù)據(jù)庫，在搜索欄中輸入PKP3,在樣本數(shù)據(jù)庫中選擇胰腺癌(PAAD),分析PKP3蛋白在胰腺癌組織、癌旁組織的表達差異，及其在不同臨床分期胰腺癌組織中的表達水平。繼續(xù)使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫深層次分析PKP3蛋白與胰腺癌患者的總生存期(overall survival,OS)及無疾病進展生存期(disease free survival,DFS)的關(guān)系。參照PKP3蛋白的表達水平的中位數(shù),將數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌患者分為高表達組及低表達組,對兩組患者進行生存預(yù)后分析。

1.2 觀察PKP3蛋白在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達差異

The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(http://www.proteinatlas.org)是收集各地研究員在實驗室中使用特殊的抗體，用免疫組化染色方法顯示蛋白在不同組織中的表達圖像，用來分析某種蛋白在腫瘤組織與癌旁組織表達的差異。本研究使用該數(shù)據(jù)庫中的圖像數(shù)據(jù)，觀察PKP3表達差異。

1.3 PKP3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及功能分析

應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)與WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)數(shù)據(jù)庫分析與PKP3蛋白關(guān)系緊密的蛋白，記錄排在前10的蛋白，繪制網(wǎng)狀圖及分析它們與PKP3蛋白的相互作用關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用t檢驗驗證胰腺癌組織和癌旁組織中PKP3的表達差異;利用F檢驗分析不同期別胰腺癌PKP3的表達;采用Kaplan-Meier法計算PKP3的表達水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織與癌旁組織及不同期別胰腺癌組織中PKP3蛋白的表達比較

收集GEPIA數(shù)據(jù)庫中的350例標本(179例胰腺癌組織標本及171例正常胰腺組織標本),經(jīng)統(tǒng)計學方法整理分析后發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中PKP3蛋白表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.01),如圖1所示。更深入地分析不同病理期別胰腺癌組織中該基因的表達,發(fā)現(xiàn)病理分期Ⅰ～Ⅳ期胰腺癌組織中該基因表達差異并無統(tǒng)計學意義(HR=1.4,P=0.034),如圖2所示。

圖1 PKP3蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織的表達情況

圖2 不同分期胰腺癌組織中PKP3蛋白表達比較

2.2 胰腺癌中PKP3 蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系

利用 GEPIA 數(shù)據(jù)中胰腺癌患者的生存數(shù)據(jù)進一步分析,以PKP3蛋白表達的中位數(shù)為標準,將數(shù)據(jù)庫中胰腺癌患者分為PKP3 蛋白高表達組和低表達組,與低表達組比較,PKP3蛋白高表達患者OS明顯縮短(HR=1.4,P=0.034),而DFS比較差異無統(tǒng)計學意義(HR=1,P=0.890),見圖 3、4。

圖3 PKP3蛋白表達與胰腺癌患者OS的關(guān)系

2.3 胰腺癌組織和正常胰腺組織中PKP3蛋白表達水平比較

基于The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫分析胰腺癌

圖4 PKP3 蛋白表達與胰腺癌患者DFS的關(guān)系

組織和癌旁組織中PKP3 蛋白分布情況。分析得出PKP3蛋白在癌旁組織與胰腺癌組織中均主要定位于囊泡和細胞膜,染色呈藍紫色。但在胰腺癌組織中染色明顯較深，如圖5。

2.4 PKP3的生物信息學分析

在String 數(shù)據(jù)庫中對與PKP3相關(guān)聯(lián)的蛋白進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)了10 個與PKP3在功能及定位上相關(guān)的蛋白,包括DSG1、DSG3、DSG4、DSC1、DSC2、DSC3、DSP、JUP、PPL、DSG2(圖5),利用WebGestalt進一步對這些蛋白分析發(fā)現(xiàn),這些蛋白主要構(gòu)成細胞膜、囊泡等細胞結(jié)構(gòu)。參與多細胞生物進程、細胞發(fā)展過程等過程,發(fā)揮結(jié)合蛋白質(zhì)、結(jié)合離子等功能。

圖5 PKP3功能及定位相關(guān)蛋白

3 討論

Plakophilins(PKPs)蛋白家族包括PlakoF(PKPl)、Plakophilin 2(PKP2)及Plakophilin 3(PKP3)，同屬于細胞黏附分子P120ctn家族，其共同特點為分子結(jié)構(gòu)中具有特征性的Armadillo重復(fù)序列，具體為45個氨基酸，且與P120ctn該序列的相似50%。PlakophilinsmRNA主要存在于橋粒，對細胞橋粒的組成及功能維持有重要作用[3]。PKP3表達異常引起細胞黏連的缺失，繼而導致腫瘤細胞處在高活性及高侵潤性，使部分腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤中分離，實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Aigner[4]與Papagerakis[5]完善實驗證實PKP3的低表達與口腔癌及結(jié)腸癌的進展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。Li等[6]認為在鼻咽癌組織中，PKP3受miR-149的負向調(diào)節(jié)，與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。但能否通過調(diào)整PKP3表達水平控制腫瘤轉(zhuǎn)移暫無報道，仍需后期實驗證實。 PKP3存在于細胞間橋粒組織中,是一種細胞間黏連蛋白,是細胞間黏連的主要組織,它與細胞橋粒的粘附構(gòu)成了細胞間的連接[7]?，F(xiàn)有研究證實在不同來源、不同組織病理學分期腫瘤組織與對應(yīng)的癌旁組織之間的PKP3基因的表達模式存在差異,Papagerakis等[8]發(fā)現(xiàn)在口咽小細胞癌中,PKP3表達與腫瘤組織學分期呈負相關(guān)。Schwarz等[9]發(fā)現(xiàn)PKP3基因在腫瘤細胞中的表達明顯高于正常胰腺組織,與本研究一致。綜上所述,PKP3基因表達異常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。 本課題研究178例胰腺癌患者總體預(yù)后時發(fā)現(xiàn)：高表達PKP3基因的胰腺癌患者總體生存時間、無進展生存時間明顯縮短。有前期研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、胃癌、宮頸癌患者中，PKP3基因高表達明顯降低患者生存時間[10-12]，與本研究一致。說明PKP3基因與腫瘤患者的生存時間密切相關(guān)。且有研究證實:PKP3的表達很有可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)[13]。國外有報道通過調(diào)低PKP3表達后發(fā)現(xiàn)連接細胞橋粒體積縮小、細胞間粘附性下降，促進腫瘤細胞增長及轉(zhuǎn)移[14]。而本研究結(jié)論提示高PKP3表達同樣明顯降低患者生存時間，推測原因可能因為：在腫瘤外因驅(qū)使下，細胞粘附蛋白排列紊亂，細胞橋粒體積過小，兩者喪失粘附作用，導致腫瘤局部進展及轉(zhuǎn)移。通過String及WebGestalt數(shù)據(jù)庫對PKP3及相關(guān)蛋白分析顯示,與PKP3蛋白相關(guān)的功能蛋白主要位于細胞膜、囊泡等膜性結(jié)構(gòu)中,參與多細胞生物進程、細胞發(fā)展過程等過程,在結(jié)合蛋白、離子等過程中發(fā)揮著重要作用,但其具體功能有待進一步驗證。

以往的實驗研究方法一次僅能研究少數(shù)或幾個基因,但隨著測序技術(shù)的不斷的改進和升級及基因組學和蛋白組學的大規(guī)模應(yīng)用,產(chǎn)出的研究成果翻了幾倍。如今的公共數(shù)據(jù)庫整合了多項研究成果,利用當前的生物信息分析技術(shù)對公共數(shù)據(jù)庫中的海量信息進行整合分析,更有利于從多個角度探索某個或某些基因與疾病的內(nèi)在聯(lián)系,為更深層次了解疾病打下基礎(chǔ)。使用公共數(shù)據(jù)庫進行初步分析，后期結(jié)合體外實驗進行驗證及擴展，已成為現(xiàn)如今科研新方向。

PKP3蛋白存在于生物體內(nèi)幾乎所有器官中，在不同腫瘤組織中表達水平各不相同，但其表達差異引起細胞間黏性改變，繼而引起腫瘤進展及轉(zhuǎn)移。本研究通過多個生物數(shù)據(jù)庫得出結(jié)論：在胰腺癌組織中PKP3蛋白呈高表達,其表達水平與患者不良預(yù)后呈正相關(guān),PKP3蛋白參與多種生物學過程,有希望成為胰腺癌診斷和治療的新靶點,但其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體功能有待進一步體內(nèi)外實驗探究。