劉 晨 劉 穩(wěn)

下咽鱗狀細胞癌發(fā)生率約占頭頸部鱗狀細胞癌的3%～5%[1]，多發(fā)生在梨狀窩，其次為咽后壁，環(huán)后區(qū)較少，是一種相對少見的惡性腫瘤，多隱匿起病，明確診斷時多已為Ⅲ～Ⅳ期患者，且淋巴轉(zhuǎn)移與遠處轉(zhuǎn)移率遠高于其他頭頸部惡性腫瘤[2-3]。盡管隨著醫(yī)學(xué)的進步，下咽鱗狀細胞癌的治療上有一定的進展，但因其發(fā)病隱匿、惡性程度高、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點，下咽鱗癌在頭頸部惡性腫瘤中預(yù)后極差，5年生存率在25%～53%之間[4-5]。因此研究下咽癌的發(fā)病機理及尋找相關(guān)特異性分子標志物并明確新的治療靶點，在改善下咽癌診治策略，提高患者生存率方面具有重要意義。

環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶。COX有兩種同工酶COX-1和COX-2。COX-2由花生四烯酸轉(zhuǎn)化而成，研究證實其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[6]。

頭頸部腫瘤發(fā)病過程中，細胞增殖周期起到非常重要的作用。Ki-67抗原是1983年由Gerdes等發(fā)現(xiàn)的在增殖細胞中表達的核抗原，是目前公認的細胞核增值標志物[7]。有研究表明，Ki67的表達能可靠迅速地反映多種惡性腫瘤增殖率，與其發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)[8-9]。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法和Western-blot對下咽鱗癌組織進行COX-2和Ki-67檢測，分析2種標志蛋白的表達與下咽鱗癌臨床病理學(xué)特征及生物學(xué)行為的相關(guān)性，初步探討COX-2和Ki-67作為評價下咽鱗癌發(fā)生發(fā)展中生物學(xué)行為的標志蛋白的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究納入徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科2013年1月至2015年6月的下咽癌病例資料及手術(shù)標本共36例。所有腫瘤組織均經(jīng)病理學(xué)確診為鱗狀細胞癌，并且術(shù)前均未行放療、化療。其中包括高分化癌32例，低分化癌4例，臨床分期：T1、T2期共15例，T3、T4期共21例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例(有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果而定)。所有標本均經(jīng)患者知情同意后手術(shù)切除獲得，標本獲取后分兩部分保存：①經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片；②液氮凍存。

1.2 方法及試劑

1.2.1 免疫組織化學(xué) 采用免疫組化SP法。特異性一抗為兔抗人COX-2單克隆抗體(北京中杉金橋ZA-0515)和鼠抗人Ki-67單克隆抗體(北京中杉金橋TA500265)、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。實驗過程嚴格按說明書操作。標本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，做成5 μm厚的組織切片,常規(guī)脫蠟水化，PBS沖洗3×5 min,置10 mmol檸檬酸緩沖液,用微波處理修復(fù)抗原、蒸餾水PBS各沖洗3×5 min。每張切片滴加50 μl第一抗體4 ℃ 孵育過夜，PBS沖洗3×5 min后甩去PBS液，每張切片滴加50 μl 工作濃度為1∶100 的生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3×5 min后甩去PBS液，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水透明封片。PBS緩沖液代替一抗作陰性，用已知COX-2和Ki-67陽性的肺癌標本切片為陽性對照，以PBS液代替一抗為陰性對照。

免疫組化染色切片在高倍顯微鏡(200×)下觀察，隨機選擇5個視野，以腫瘤細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，計算每個視野COX-2和Ki-67陽性細胞率，取平均值作為該標本的陽性細胞率。根據(jù)顯色強度和范圍，COX-2和Ki-67表達分為陰性(-)：<10%；弱陽性(+)：10%～50%之間；強陽性(++)：>50%。

1.2.2 Western-blot檢測COX-2 將液氮中凍存的組織標本取出稱重，每100 mg加入400 μl蛋白裂解液，置于勻漿器中反復(fù)研磨組織，使組織充分勻漿化，冰上充分裂解30 min，12000 r/min離心收集上清液，用BCA法測上清蛋白濃度。將蛋白置于12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)膜1.2 h,加入COX-2兔抗人多克隆抗體(1∶500)及β-actin小鼠抗人單克隆抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜漂洗，加二抗(1∶2000)室溫孵育1 h滴加發(fā)光試劑暗室曝光顯示條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計學(xué)處理采用卡方檢驗和Fisher確切概率法。檢驗標準P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)方法檢測下咽癌組織中COX-2 和Ki-67蛋白的表達情況

2.1.1 COX-2和Ki-67在下咽鱗癌組織中高表達 COX-2在下咽鱗癌組織中，陽性細胞總表達率為77.8%，主要位于癌細胞浸潤灶、下咽癌角化珠和壞死灶周圍,棕黃色陽性顆粒彌漫分布于癌細胞的胞質(zhì)或沿核膜周邊呈線狀分布,而且血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)也有染色(表1)。Ki-67陽性總表達率為83.3%，陽性染色主要定位于下咽癌腫瘤細胞核，為棕黃色顆粒，呈彌漫性分布(表1)。

表1 COX-2表達和Ki-67表達情況比較(例，%)

2.1.2 不同臨床分期下咽癌組織中COX-2和Ki-67的表達 在不同臨床分期下咽鱗狀細胞癌中，COX-2和Ki-67陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異。與T1、T2期下咽鱗狀細胞癌比較，T3、T4期癌組織中COX-2和Ki-67陽性率均明顯增高，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同臨床分期下咽癌組織中COX-2和Ki-67的表達(例，%)

2.1.3 COX-2和Ki-67表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 COX-2和Ki-67陽性率與下咽鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中COX-2和Ki-67陽性率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 COX-2和Ki-67表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系(例，%)

2.2 Western-blot檢測下咽癌組織中COX-2蛋白表達水平

Western-blot檢測結(jié)果顯示：COX-2在下咽癌組織中表達水平明顯高于下咽癌旁正常黏膜組織。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1、圖2)。

注：圖片取自72例樣本W(wǎng)estern-blot中的代表性結(jié)果；NC為癌旁正常組織；Ca為癌組織。

圖2 下咽癌和癌旁正常組織中COX-2表達量

3 討論

環(huán)氧合酶(COX)是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，其本質(zhì)是一種膜結(jié)合蛋白，具有兩種異構(gòu)體形式，即COX-1和COX-2，其中COX-1在大多數(shù)組織中表達，并介導(dǎo)用于維持正常生理功能的腎上腺素；而多數(shù)組織在正常生理條件下并不能檢測到COX-2的表達，但會因受到如炎癥反應(yīng)、生長因子、原癌基因和腫瘤促進劑等的刺激而迅速合成[10-11]，包括頭頸部惡性腫瘤等各種癌癥發(fā)病過程中將會表達上調(diào)[12-13]。COX-2主要通過抑制機體免疫功能 、抑制細胞凋亡,促進腫瘤組織血管形成、增加腫瘤的侵襲能力和促進癌前病變向腫瘤轉(zhuǎn)化而參與癌的形成[14-15]。

Ki-67是一種增殖細胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，僅在細胞周期增殖階段釋放，標記著細胞增殖的狀態(tài)[7]。有研究認為[8]，Ki-67在頭頸部鱗狀細胞癌的發(fā)病過程中能夠作為放療敏感性的預(yù)測指標，但不能作為化療敏感性的預(yù)測指標。然而現(xiàn)有的研究結(jié)論尚不完全統(tǒng)一[16-19]，甚至有些矛盾之處，目前比較公認的是Ki-67的表達表明細胞處于增殖期而不能表明細胞增殖的速度[20-21]。因此進一步研究Ki-67與惡性腫瘤生物學(xué)行為之間的關(guān)系具有重要意義。

本研究表明：較高T分期的下咽癌或存在淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移時，腫瘤組織中COX-2和Ki-67陽性細胞數(shù)增多，陽性率顯著升高。癌組織中COX-2的表達量顯著高于癌旁正常組織，表明COX-2和Ki-67在喉癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)行為中可能起著重要的作用，可能促進癌組織的生長、增值及轉(zhuǎn)移，這與二者在其他頭頸部鱗狀細胞癌相關(guān)研究中結(jié)論一致[22]。

綜上所述，COX-2和Ki-67可能作為下咽鱗狀細胞癌早期診斷及預(yù)后判斷的分子指標之一，聯(lián)合檢測COX-2和Ki-67可能對判斷下咽鱗癌的進展及預(yù)后有一定參考價值。