雷小蕾 劉建峰 葉鐵良 張帥虎 袁國靜

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，約占所有兒科惡性腫瘤的2.4%[1]。骨肉瘤患者常用的化療藥物包括順鉑、阿霉素和甲氨蝶呤，但化療藥物耐藥情況也越發(fā)普遍[2]?；熕幬镯樸K(cisplatin，CDDP)在臨床上主要用于實(shí)體瘤的治療，它抗癌譜廣，是目前已知的最有效的抗腫瘤藥物之一，也是骨肉瘤化療的一線用藥[3]。然而臨床上在使用順鉑化療的過程中，患者易產(chǎn)生耐藥，這可能與藥物的不規(guī)范使用、腫瘤細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性及高突變率等有關(guān)[4]。但是關(guān)于臨床治療中骨肉瘤化學(xué)耐藥性的分子機(jī)制尚不清楚。miRNA(microRNA)是一類由內(nèi)源性基因編碼的非編碼單鏈 RNAs，長度約為 22 個(gè)核苷酸，主要在翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)[5]。miRNA 在腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要作用，其在耐藥細(xì)胞和對(duì)藥物敏感的細(xì)胞中的表達(dá)量存在差異[6]。miR-95和 miR-19b 與多種類型腫瘤的發(fā)生高度相關(guān)[7]，但是與骨肉瘤以及順鉑耐藥性的關(guān)系尚不明確。因此本研究探討miR-95和 miR-19b 在骨肉瘤組織中的表達(dá)及與順鉑耐藥性的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年2月至2020年2月本院收治的骨肉瘤患者100例，其中男性54名，女性46名，年齡6～69歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《骨肉瘤臨床循證診療指南》[7]，經(jīng)病理學(xué)確診骨肉瘤；②病歷、臨床資料完整；③患者簽署自愿受試同意書，患者及其家屬需簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神疾病患者；②合并其他惡性腫瘤患者；③合并其他器官嚴(yán)重性病變患者；④排除糖尿病、腎病等其他代謝性疾病的患者。

1.2 miR-95和 miR-19b 水平檢測(cè)

取骨肉瘤組織樣本，使用TRIzol RNA試劑盒(購自賽默飛世爾科技有限公司)提取總RNA，紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)公司)檢測(cè)總RNA 濃度及純度。取 2 μg 總 RNA 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2-ΔΔCt法計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 化療耐藥分析

患者可根據(jù)鉑類耐藥評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[8]分為敏感組和耐藥組，敏感組為患者在化療完成后處于完全緩解狀態(tài)，后期復(fù)發(fā)間隔6個(gè)月以上；耐藥組為患者在化療完成后處于癥狀未緩解狀態(tài)或者處于完全緩解狀態(tài)但是后期復(fù)發(fā)間隔在6個(gè)月以內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-95和 miR-19b 表達(dá)與骨肉瘤患者的臨床病理參數(shù)關(guān)系分析

根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-95和 miR-19b表達(dá)與性別無關(guān)(P均>0.05)，與臨床分期、腫瘤直徑以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，其中臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者miR-95表達(dá)水平顯著低于其他患者(P<0.05)，臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者miR-19b 表達(dá)水平顯著高于其他患者(P<0.05)，見表1。

表1 miR-95和 miR-19b表達(dá)與骨肉瘤的臨床病理資料關(guān)系

2.2 miR-95和 miR-19b表達(dá)與化療耐藥的關(guān)系

miR-95在耐藥組的表達(dá)水平明顯低于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-19b在耐藥組的表達(dá)水平明顯高于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 miR-95和 miR-19b在耐藥組與敏感組中的表達(dá)水平

2.3 miR-95和miR-19b對(duì)骨肉瘤患者化療耐藥的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

根據(jù)ROC曲線分析可知，miR-95和miR-19b評(píng)估骨肉瘤患者化療耐藥的預(yù)測(cè)AUC分別為0.707、0.692，聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.808，高于單獨(dú)檢測(cè)的AUC值。見表3，圖1。

表3 miR-95和 miR-19b聯(lián)合檢測(cè)骨肉瘤預(yù)測(cè)效能評(píng)價(jià)

圖1 miR-95和 miR-19b對(duì)骨肉瘤化療耐藥的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線分析

3 討論

骨肉瘤是高度惡性的間葉組織腫瘤，年發(fā)病率約為3/100萬，由于骨肉瘤局部侵襲性生長并易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9-10]。與其他癌癥類型相比，骨肉瘤的分子發(fā)病機(jī)制尚不清楚。骨肉瘤患者的5年總體和無病生存率為50%～60%，約40%的患者死于肺轉(zhuǎn)移[11]。近年來，順鉑的新輔助化療被廣泛用于降低骨肉瘤患者的復(fù)發(fā)率和提高生存率[12]。對(duì)化療藥物的耐藥性仍然是骨肉瘤和癌癥治療的主要問題。目前臨床上對(duì)化療耐藥的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)患者在化療結(jié)束后根據(jù)化療效果以及復(fù)發(fā)情況來判斷，不能及時(shí)根據(jù)耐藥情況調(diào)整治療藥物，影響患者的治療效果，因此尋找有效的針對(duì)子宮內(nèi)膜癌化療耐藥情況的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)臨床研究具有重大意義。

miRNA 是一種高度保守的非編碼RNA分子，具有18～25個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[13]。miRNA參與多種細(xì)胞過程，如分化、增殖和凋亡，這些過程在癌癥的發(fā)展中具有重要意義，越來越多的研究表明miRNA可能與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。miR-95過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤生長[16]。研究表明miR-19b可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生[17]。有研究稱與正常黑色素細(xì)胞相比，黑色素瘤細(xì)胞中miR-19b的表達(dá)顯著增加[18]。在骨肉瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了miR-19b的上調(diào)表達(dá)，并在這種惡性腫瘤中發(fā)揮了促癌作用[19]。但是miR-95和miR-19b在骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制和化療耐藥中的潛在作用尚未闡明。本研究結(jié)果顯示：miR-95和miR-19b表達(dá)與臨床分期、腫瘤直徑以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示了miR-95和miR-19b可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，但是具體發(fā)病機(jī)制亟待進(jìn)一步研究。miR-95在耐藥組的表達(dá)水平明顯低于敏感組，miR-19b在耐藥組的表達(dá)水平明顯高于敏感組。miR-95和miR-19b評(píng)估骨肉瘤患者化療耐藥的預(yù)測(cè)AUC分別為0.707、0.692，聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.808，高于單獨(dú)檢測(cè)的AUC值。說明miR-95和miR-19b水平與骨肉瘤對(duì)化療耐藥有關(guān)，與目前的研究所推測(cè)的一致，另外還發(fā)現(xiàn)其對(duì)骨肉瘤化療耐藥有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，可作為骨肉瘤化療耐藥相關(guān)生物標(biāo)志物的潛力。

綜上所述，本研究證實(shí)了miR-95和miR-19b與骨肉瘤病理參數(shù)的關(guān)系以及對(duì)化療耐藥預(yù)測(cè)的價(jià)值，為未來尋求一種有效與骨肉瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。然而本研究由于樣本量少以及中心單一等不足對(duì)研究結(jié)果可能產(chǎn)生一定的偏移，在未來的研究中需要更具前瞻性以及擴(kuò)大樣本量來對(duì)結(jié)果進(jìn)一步完善。