李國芳 韓永付 鄭 雷 李曉琰 高振杰

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous-cell carcinoma，OSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居口腔癌首位，且逐年攀升并趨于年輕化[1]。目前臨床治療OSCC通常采用化療聯(lián)合手術(shù)切除，但由于腫瘤生長位置特殊，可能會(huì)損壞患者面部形象或造成面部器官功能障礙，治療效果并不理想[2]。此外，OSCC隱蔽性強(qiáng)，部分患者確診時(shí)已處于晚期，出現(xiàn)組織浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以致患者病死率居高不下[3]。橙皮苷是柑橘類成熟果皮和組織中的類黃酮物質(zhì)，有研究證明，其可通過抑制人肝癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡來發(fā)揮抗癌功效[4]。然而，目前關(guān)于其對(duì)于OSCC細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究采用橙皮苷干預(yù)OSCC細(xì)胞，觀察其對(duì)該細(xì)胞克隆、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人OSCC CAL27細(xì)胞系、人口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞(Human Oral Keratinocytes，HOK)系，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑、儀器 橙皮苷(純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)全蛋白提取試劑盒、pcDNA 3.1-甲基化CpG結(jié)合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)質(zhì)粒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)，LipofectamineTM3000試劑盒(上海臻諾生物科技有限公司)，兔抗人MeCP2、Wnt-1、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、腺瘤樣結(jié)腸息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白一抗(美國Santa公司)。

倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)，DYCZ-24電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Gel Doc XR+一體式凝膠成像分析儀(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人OSCC CAL27細(xì)胞、HOK細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素雙抗)中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合至80%后，采用胰蛋白酶消化、傳代，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)MeCP2在HOK、CAL27細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)量 取HOK、CAL27對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液，注入離心管，以10000 r/min，離心半徑r=10 cm離心15 min，BCA法測(cè)定蛋白含量。取50 μg待測(cè)蛋白，按比例與上樣緩沖液混合，經(jīng)水煮沸5 min，同條件離心取其上清，80 V恒壓上樣電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉液室溫?fù)u床封閉2 h，TBST清洗，加入兔抗人MeCP2一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗，加入ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，經(jīng)一體式凝膠成像系統(tǒng)分析，以MeCP2蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞干預(yù)、轉(zhuǎn)染、分組[5]取對(duì)數(shù)期CAL27細(xì)胞，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種至6孔板，待細(xì)胞再次融合至60%時(shí)，分為空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達(dá)組、橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組?？瞻捉M不處理，橙皮苷組培養(yǎng)基加入橙皮苷(100 μmol/L終濃度)，MeCP2過表達(dá)組根據(jù)LipofectamineTM3000試劑盒說明書步驟，轉(zhuǎn)染MeCP2蛋白過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA 3.1-MeCP2，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-MeCP2后，加入橙皮苷(100 μmol/L終濃度)。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，干預(yù)或轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)各組MeCP2蛋白表達(dá)量 取各組細(xì)胞，操作同1.2.2。

1.2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組克隆能力 轉(zhuǎn)染48 h后，取各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化、傳代，吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞密度300個(gè)/mL接種于培養(yǎng)皿中(含培養(yǎng)液10 mL)，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，待出現(xiàn)肉眼可見的克隆細(xì)胞時(shí)，終止培養(yǎng)。棄其上清液，PBS洗滌干凈，加入4%多聚甲醛4 ℃固定15 min，棄去固定液，PBS洗滌，加入結(jié)晶紫染液37 ℃染色25 min，自來水沖洗，風(fēng)干，將平皿倒置于透明膠片上，低倍鏡下記錄克隆數(shù)并拍照。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組遷移能力 取各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化、重懸。以1×106個(gè)/mL接種至6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，用移液器槍頭沿孔板中央垂直向下畫一條直線，PBS輕吹除去邊緣細(xì)胞碎片，置于完全培養(yǎng)基繼續(xù)培育24 h，置于顯微鏡下拍照記錄培養(yǎng)前劃痕寬度及培育24 h后劃痕寬度，觀察細(xì)胞遷移情況，計(jì)算各組遷移率。遷移率=(培養(yǎng)前劃痕寬度-培育24 h后劃痕寬度)/培養(yǎng)前劃痕寬度×100%。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組侵襲能力 取Matrigel膠冰浴融化，加入PBS稀釋，以50 μL/孔置于Transwell小室濾膜上，取各組OSCC CAL27細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，接種于Transwell小室上層，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出杯底濾膜，PBS沖洗，加入0.25%戊二醛固定15 min，加結(jié)晶紫染液37 ℃染色25 min，自來水沖洗，風(fēng)干。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照并記錄各視野穿模細(xì)胞數(shù)，取其均值。

1.2.8 Western blot法檢測(cè)Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達(dá)量 取各組細(xì)胞。同1.2.2洗滌、裂解、定量、變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育。分別加入相應(yīng)抗體Wnt-1、β-catenin、APC一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗，加入ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，經(jīng)一體式凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MeCP2在HOK、CAL27細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)量

HOK、CAL27細(xì)胞系中MeCP2蛋白表達(dá)量分別為(0.43±0.03)、(0.61±0.05)，與HOK細(xì)胞系比較，MeCP2在CAL27細(xì)胞系中蛋白表達(dá)量升高(t=6.903，P<0.05)。見圖1。

圖1 Western blot法檢測(cè)HOK、CAL27細(xì)胞系中MeCP2蛋白表達(dá)量

2.2 轉(zhuǎn)染后MeCP2蛋白表達(dá)量

轉(zhuǎn)染48 h后，空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達(dá)組、橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組MeCP2蛋白表達(dá)量分別為(0.63±0.06)、(0.24±0.02)、(0.94±0.09)、(0.41±0.04)，與空白組比較，橙皮苷組MeCP2蛋白表達(dá)量降低，MeCP2過表達(dá)組MeCP2蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組MeCP2蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；與MeCP2過表達(dá)組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組MeCP2蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組MeCP2蛋白表達(dá)量

2.3 克隆能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達(dá)組、橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組克隆數(shù)分別為(203.00±29.93)個(gè)、(74.50±10.52)個(gè)、(285.00±35.41)個(gè)、(122.50±19.97)個(gè)，與空白組比較，橙皮苷組克隆數(shù)減少，MeCP2過表達(dá)組克隆數(shù)增加(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組克隆數(shù)增加(P<0.05)；與MeCP2過表達(dá)組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組克隆數(shù)減少(P<0.05)。見圖3。

圖3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆能力

2.4 遷移能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達(dá)組、橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組遷移率分別為(71.88±8.23)%、(51.67±5.37)%、(90.36±9.52)%、(64.44±6.74)%，與空白組比較，橙皮苷組遷移率降低，MeCP2過表達(dá)組遷移率升高(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組遷移率升高(P<0.05)；與MeCP2過表達(dá)組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組遷移率降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力(×100，標(biāo)尺50 μm)

2.5 侵襲能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達(dá)組、橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(70.40±7.60)個(gè)/視野、(13.40±3.80)個(gè)/視野、(124.60±13.80)個(gè)/視野、(38.20±4.40)個(gè)/視野，與空白組比較，橙皮苷組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，MeCP2過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)；與MeCP2過表達(dá)組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。見圖5。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲能力(×200，標(biāo)尺200 μm)

2.6 Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，橙皮苷組Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)降低、APC蛋白表達(dá)升高，MeCP2過表達(dá)組Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)升高，APC蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)升高，APC蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與MeCP2過表達(dá)組比較，橙皮苷+MeCP2過表達(dá)組Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)降低、APC蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見表1，圖6。

圖6 Western blot法檢測(cè)各組Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達(dá)

表1 各組細(xì)胞Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達(dá)

3 討論

OSCC是源自口腔黏膜的鱗狀細(xì)胞癌，早期通常表現(xiàn)為表淺潰瘍，逐漸出現(xiàn)病理性白斑、紅斑，進(jìn)而進(jìn)展為腫瘤侵入口腔內(nèi)部組織[6],其危險(xiǎn)因素包括不良生活習(xí)慣，如吸煙、飲酒、食用檳榔、感染HPV等[7]。目前關(guān)于OSCC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究認(rèn)為其與基因突變、微小RNA調(diào)控、抑癌基因產(chǎn)物改變DNA代謝調(diào)節(jié)有關(guān)[8]。惡性程度高、病程發(fā)展快、侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高是OSCC的主要特征，且多數(shù)患者確診時(shí)已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是高復(fù)發(fā)率和病死率的重要原因[9]。由此可見，研究抑制OSCC細(xì)胞克隆、侵襲、遷移等惡性細(xì)胞學(xué)行為的方式，是提升患者生存率，改善預(yù)后的有效途徑。

近年來，天然提取物常被用于抗癌治療，因其高效、低副作用的特點(diǎn)，已成為臨床研究熱點(diǎn)。橙皮苷廣泛存在于柑橘屬、蕓香科、茜草科、十字花科植物果實(shí)或根莖中，具有抗炎、抗衰老、提升免疫力、保護(hù)心腦血管、防止血液凝聚及抗癌等多種生物學(xué)活性[10]。L等[11]在研究橙皮苷的抗癌活性及其作用機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，其可抑制體外人前列腺癌細(xì)胞活力，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)其凋亡，并降低其遷移、侵襲能力，提示其具有潛在的體外抗癌作用。作為天然抗氧化保健品，橙皮苷及其衍生物可清除超氧陰離子自由基，減少DNA損傷，降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[12]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，橙皮苷組克隆數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)減少，遷移率降低，提示橙皮苷可抑制OSCC細(xì)胞克隆、侵襲、遷移。

DNA甲基化是引發(fā)抑癌基因失活的重要原因之一[13]。MeCP2蛋白是甲基化結(jié)合蛋白家族成員，可與甲基化DNA結(jié)合或經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別甲基化DNA，進(jìn)而調(diào)控其下游蛋白表達(dá)，參與增殖、侵襲、遷移、凋亡等多種細(xì)胞功能調(diào)控[14]。有研究表明[15]，MeCP2在乳腺癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，敲降MeCP2可抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)其凋亡。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是引發(fā)腫瘤的重要通路之一，其中Wnt1表達(dá)水平與該信號(hào)通路活性有關(guān)。APC是一種抑癌基因，其蛋白參與β-catenin濃度調(diào)控。正常細(xì)胞內(nèi)β-catenin與APC結(jié)合呈低表達(dá)狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)，APC基因缺失或突變，β-catenin大量游離，進(jìn)入核內(nèi)參與調(diào)控基因表達(dá)，誘發(fā)Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活[16]。Zhang等[17]研究認(rèn)為，MeCP2高表達(dá)可激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑來促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)OSCC發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與HOK細(xì)胞系比較，CAL27細(xì)胞系MeCP2蛋白表達(dá)量升高，提示MeCP2在OSCC細(xì)胞異常低表達(dá)；與空白組比較，MeCP2過表達(dá)組Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)升高，APC蛋白表達(dá)降低，且與橙皮苷聯(lián)用可減弱轉(zhuǎn)染MeCP2對(duì)OSCC惡性行為的影響，提示橙皮苷抑制OSCC細(xì)胞克隆、侵襲、遷移的機(jī)制可能與調(diào)控MeCP2，進(jìn)而調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，橙皮苷可抑制OSCC細(xì)胞克隆、侵襲、遷移，其作用機(jī)制可能與抑制MeCP2，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。