黃瑩瑩 李海朋 裴 浩

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)來(lái)源于口腔上皮細(xì)胞，是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，已被列為世界第八大惡性腫瘤，由于其具有高發(fā)生率、高致死率和高轉(zhuǎn)移率，所以O(shè)SCC一直都是臨床工作者的關(guān)注重點(diǎn)。層粘連蛋白γ2(laminin γ2 chain gene，LAMC2)是層粘連蛋白家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)，LAMC2在食管鱗癌中高表達(dá)[1]，此外，LAMC2可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境的pH值，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的清洗和遷移[2-3]。血清LAMC2可作為肝癌預(yù)后的診斷標(biāo)志物[4]。Wang等研究報(bào)道稱人OSCC細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡中富集大量LAMC2，可促進(jìn)體外淋巴管再生[5]，但該基因?qū)Π┘?xì)胞的惡性行為學(xué)的影響未進(jìn)行探討，因此本研究以人舌鱗癌細(xì)胞TSCC為研究對(duì)象，探討LAMC2對(duì)癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，旨在為臨床治療OSCC提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人OSCC細(xì)胞CAL-27購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所。

1.2 試劑與儀器

含有si-LAMC2、LAMC2-NC、LAMC2、LAMC2-NC的pcDNA3.1重組質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪生物科技有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒以及PCR引物購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；神經(jīng)鈣粘蛋白(N-cadherin，N-cad)、上皮鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、波形蛋白(vimentin)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-TEK公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將CAL-27細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每2 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，并傳代，待細(xì)胞傳至第4代時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞重懸，制成細(xì)胞密度為1×105的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、si-NC組、si-LAMC2組、LAMC2-NC組、LAMC2組。對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理，其余4組分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-LAMC2、LAMC2-NC、LAMC2，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，待轉(zhuǎn)染成功率達(dá)到85%時(shí)，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR法檢測(cè)LAMC2的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，利用RNA試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計(jì)算LAMC2的表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞將細(xì)胞重懸，以5×103/個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換含有0.5% MTT溶液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔中加入100 μl DMSO，振蕩混勻后，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光度(A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

轉(zhuǎn)染48 h后，3000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。冰PBS清洗細(xì)胞2次，加入400 μl Binding Buffer將細(xì)胞重懸，加入5 μl annexin V避光反應(yīng)20 min，再加入4 μl碘化丙啶，振蕩混勻后，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù)

轉(zhuǎn)染48 h后，無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，制成密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。將100 μl細(xì)胞懸液接種于經(jīng)Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室的上室中，下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄掉下室中的培養(yǎng)基，棉簽擦去上室膜上的細(xì)胞，甲醛固定下室中入侵的細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.8 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量

轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，加入40 μl RIPA裂解液，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，100 ℃煮沸10 min使蛋白處于穩(wěn)定狀態(tài)。凝膠電泳，每孔20 μl蛋白樣品，80 v電泳20 min，使蛋白樣品至分離膠后120 v恒壓電泳2 h，電泳結(jié)束后，0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜3次，5 min/次，室溫封閉1 h，E-cad、N-cad、vimentin、GAPDH一抗(1∶1000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，ECL法顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

LAMC2表達(dá)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和si-NC組比較，si-LAMC2組LAMC2表達(dá)降低(P<0.05)；與對(duì)照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組LAMC2表達(dá)升高(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組LAMC2表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 LAMC2表達(dá)量比較

2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞存活率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和si-NC組比較，si-LAMC2組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)；與對(duì)照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 細(xì)胞存活率比較

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和si-NC組比較，si-LAMC2組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與對(duì)照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 細(xì)胞凋亡率比較

2.4 侵襲細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果

侵襲細(xì)胞數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和si-NC組比較，si-LAMC2組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與對(duì)照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.5 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果

E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和si-NC組比較，si-LAMC2組E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，N-cad、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與對(duì)照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，N-cad、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，N-cad、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。見(jiàn)表6、圖1。

表6 E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：A為對(duì)照組;B為si-NC組;C為si-LAMC2組;D為L(zhǎng)AMC2-NC組;E為L(zhǎng)AMC2組。

3 討論

頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤中，約90%以上為OSCC[6]，其病因包括遺傳、環(huán)境、感染等因素，好發(fā)于40～60歲煙酒嗜好者。目前對(duì)于OSCC的治療以手術(shù)、放化療及免疫治療為主，雖然治療手段已取得巨大進(jìn)展，但患者5年生存率仍不理想，僅有50%[7]。OSCC可發(fā)生早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具有極高的隱匿性，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約40%患者早期即發(fā)生隱匿性頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，這可能與高病死率有關(guān)。因此尋找新的治療靶點(diǎn)對(duì)OSCC患者預(yù)后不良具有重要意義。

層粘連蛋白是一類大分子糖蛋白，主要存在于上皮細(xì)胞、神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞的基質(zhì)上，該分子蛋白通常由α鏈、β鏈和γ鏈組成，形成十字形結(jié)構(gòu)[8]。LAMC2、LAMB3、LAMA3三個(gè)亞基組成異三聚體糖蛋白層粘連蛋白5，特異性表達(dá)于上皮細(xì)胞，在上皮細(xì)胞的遷移過(guò)程中具有重要作用。LAMC2僅在層粘連蛋白5中存在，對(duì)層粘連蛋白5的生理功能具有重要作用。LACM2已被報(bào)道與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，Huang等[9]研究發(fā)現(xiàn)LAMC2過(guò)表達(dá)可預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良，并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。LAMC2在喉癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)，且LAMC2表達(dá)水平與TNM分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化和總生存期相關(guān)，此外LAMC2顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力，可顯著逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗抑制喉癌細(xì)胞增殖的作用[10]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA00511通過(guò)海綿吸附于miR-765上調(diào)LAMC2的表達(dá)，促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[11]。由此可見(jiàn)，LAMC2基因可能成為治療癌癥的新的治療靶點(diǎn)，但是LAMC2對(duì)OSCC癌細(xì)胞行為學(xué)的影響鮮有報(bào)道，因此本研究以CAL27細(xì)胞為研究對(duì)象，上調(diào)或敲降細(xì)胞中LAMC2的表達(dá)，檢測(cè)癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲能力。結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)LAMC2后癌細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)、凋亡率降低，敲降LAMC2的表達(dá)后，癌細(xì)胞增殖和侵襲能力減弱，凋亡率升高。結(jié)果提示：LAMC2促進(jìn)OSCC的惡性行為學(xué)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過(guò)程，發(fā)生在上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間，當(dāng)上皮細(xì)胞受到某些刺激因素時(shí)，上皮細(xì)胞丟失原有特性，形態(tài)由原來(lái)的規(guī)則形態(tài)轉(zhuǎn)變成梭形的不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)排列，細(xì)胞極性改變，使其具有間質(zhì)細(xì)胞特性，極性改變提高細(xì)胞遷移能力，增強(qiáng)對(duì)周圍組織的侵襲[12]。該過(guò)程常發(fā)生于胚胎發(fā)育、組織纖維化以及癌細(xì)胞遷移和侵襲過(guò)程，所以在多數(shù)腫瘤的遷移和侵襲中均發(fā)生上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)GIT1誘導(dǎo)EMT過(guò)程促進(jìn)肝細(xì)胞癌遷移和侵襲。miR-29b抑制EMT過(guò)程可降低癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，以及血管再生能力[14]。Okada等[15]報(bào)道稱LAMC2逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程可抑制胰腺癌的進(jìn)展并增強(qiáng)化療藥物敏感性。發(fā)生EMT主要表現(xiàn)在上皮細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白E-cad表達(dá)下降，間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物N-cad和vimentin蛋白表達(dá)上升，E-cad屬于鈣粘蛋白家族成員，主要介導(dǎo)細(xì)胞間連接和黏附，N-cad和vimentin蛋白與癌細(xì)胞遷移侵襲、化療藥物耐藥、預(yù)后不良等密切相關(guān)。

既往研究表明，層粘連蛋白5的3個(gè)亞基LAMC2、LAMB3、LAMA3均可促進(jìn)EMT過(guò)程從而癌細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲[16]。本研通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)LAMC2對(duì)OSCC細(xì)胞癌中E-cad、N-cad、vimentin蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：上調(diào)LAMC2后，E-cad蛋白表達(dá)降低，而N-cad和vimentin蛋白表達(dá)升高，敲降LAMC2后各蛋白表達(dá)出現(xiàn)相反趨勢(shì)。結(jié)果提示：LAMC2促進(jìn)OSCC的EMT過(guò)程。

綜上所述，LAMC2促進(jìn)OSCC癌細(xì)胞增殖和侵襲、抑制凋亡，其可能是通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用，為臨床治療OSCC提供理論依據(jù)。