黃濤*，馬淑嫻* 綜述 邵毅 審校

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南昌 330006)

以往大多使用體外細(xì)胞培養(yǎng)或動物模型研究眼的生理結(jié)構(gòu)和疾病病理機(jī)制，但是由于體外細(xì)胞環(huán)境與體內(nèi)無法完全一致，且不同物種間存在較大差異，使得這些研究在臨床轉(zhuǎn)化時(shí)受到一定限制。此外，臨床疾病新型藥物的研究十分緩慢，首先要通過動物試驗(yàn)再進(jìn)入臨床人體1～3期試驗(yàn)后才可能批準(zhǔn)通過，耗資巨大且存在風(fēng)險(xiǎn)，制約了臨床相關(guān)的藥物研究。更為重要的是，由于存在倫理問題，動物實(shí)驗(yàn)和人體試驗(yàn)都面臨著諸多限制，受到廣泛爭議。

這類問題催生出了類器官與微流控芯片技術(shù)，以滿足更精準(zhǔn)的臨床前實(shí)驗(yàn)的需求。類器官是由原代組織、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced-pluripotent stem cells，iPSCs)衍生的體外三維結(jié)構(gòu)，具有自我更新和自組織能力，并表現(xiàn)出與起源組織相似的器官功能[1]。微流控芯片是一種基于微流控技術(shù)，用于模擬人體器官生理環(huán)境的仿生系統(tǒng)，通過細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)和生物材料技術(shù)的結(jié)合，可以調(diào)節(jié)濃度梯度、剪切力、細(xì)胞模式、組織邊界和組織-器官相互作用等關(guān)鍵因素，從而模擬人體組織的結(jié)構(gòu)和功能特征。類器官芯片與器官芯片的研究應(yīng)用相似，都以微流控系統(tǒng)為基礎(chǔ)，基于微流控技術(shù)用于模擬人體器官生理環(huán)境的仿生系統(tǒng)。不同之處在于器官芯片是指將人體某器官的代謝微環(huán)境在體外模擬，主要用于藥物研發(fā)及篩選方面。類器官芯片是指由原代組織、ESCs或iPSCs在芯片微環(huán)境中衍生發(fā)育的各種類器官模型，可用于發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、疾病模型、精準(zhǔn)醫(yī)療、新藥研發(fā)及篩選、藥物實(shí)驗(yàn)、再生醫(yī)學(xué)等方面。微流控芯片是實(shí)現(xiàn)微流控技術(shù)的平臺，二者的組合被稱為組織芯片或生理微系統(tǒng)，其上由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能[2]。由上述技術(shù)在體外模擬構(gòu)建的三維人體器官模型，具有接近人體水平的生理功能，同時(shí)能精確地控制多個(gè)系統(tǒng)參數(shù)，在疾病模擬和新藥研發(fā)以及精準(zhǔn)醫(yī)療等領(lǐng)域擁有廣闊的發(fā)展前景。

目前已有許多模型開始應(yīng)用類器官與微流控芯片，包括腸胃、肝、腦、腎等器官組織[3]，在眼科方面主要應(yīng)用于角膜、淚腺、視網(wǎng)膜、晶狀體等結(jié)構(gòu)。本文主要綜述這些技術(shù)在眼科的應(yīng)用，包括眼的發(fā)育、生理、疾病病理機(jī)制、個(gè)性化醫(yī)學(xué)診斷和治療方法等方面，旨在探究眼科類器官與微流控芯片的應(yīng)用前景和現(xiàn)有缺陷。

1 類器官

1.1 角膜類器官

角膜類器官是用于發(fā)育研究、角膜疾病建模的3D角膜模型，具有角膜移植的潛在價(jià)值，由ESCs和iPSCs分化出的各種角膜細(xì)胞所組成。

2014年，劉奕志教授團(tuán)隊(duì)等[4]在體外無滋養(yǎng)細(xì)胞的條件下成功擴(kuò)增了角膜緣干細(xì)胞。通過轉(zhuǎn)錄因子PAX6的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以將皮膚上皮干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榻悄ぞ壐杉?xì)胞樣細(xì)胞，并能用于移植修復(fù)損傷的大鼠角膜。2016年，Hayashi等[5]利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生的眼部細(xì)胞可產(chǎn)生自我形成的外胚層自主性多區(qū)(self-formed ectodermal autonomous multizone，SEAM)，其不同區(qū)內(nèi)的細(xì)胞指示著眼睛的多種細(xì)胞系，反映了眼睛發(fā)育的復(fù)雜性，且利用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生的角膜上皮細(xì)胞可在體外培養(yǎng)，并用于修復(fù)受損的兔眼前部。這些角膜上皮的突破性研究為角膜類器官的出現(xiàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

2017年，F(xiàn)oster等[6]首次利用人多能干細(xì)胞培育出了角膜類器官。這些類器官包含角膜上皮細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并能通過免疫熒光染色檢測到相應(yīng)的標(biāo)志物，如角膜上皮標(biāo)志物KPT3、KPT14、p63，角膜基質(zhì)標(biāo)志物CD34，角膜內(nèi)皮標(biāo)志物COL8A1、F11R、S100A4等。此后，Susaimanickam等[7]使用更為簡單有效的方法培育出了更為復(fù)雜的三維微型角膜類器官，一定情況下能形成完整的眼球樣結(jié)構(gòu)。后續(xù)的檢測顯示微型角膜與人體角膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，并能表達(dá)角膜特異性標(biāo)志物。近年的研究[8]發(fā)現(xiàn)：ABCB5可以用于對人多能干細(xì)胞來源的角膜類器官克隆細(xì)胞進(jìn)行直接檢測鑒定，并已開始逐步應(yīng)用于臨床。

雖然角膜類器官可以為移植提供細(xì)胞來源，但較長的分化時(shí)間和較大的可變性限制了這方面的應(yīng)用。同樣，角膜類器官能重現(xiàn)角膜的組織結(jié)構(gòu)，但是由于相應(yīng)的可變性，難以用于臨床前實(shí)驗(yàn)。相反，類器官分化不同時(shí)期表達(dá)的不同標(biāo)志物有利于角膜發(fā)育的研究，并可能用于闡明以往無法用其他方法模擬的疾病機(jī)制[9]。同時(shí)，角膜類器官各層含有不同的胞外基質(zhì)膠原和蛋白聚糖等重要基質(zhì)成分，外層含有基底膜蛋白聚糖和VIII型膠原蛋白，深層為基質(zhì)蛋白LUM、KERA及I型和V型膠原蛋白，這些相近的組成可以用于研究角膜的生理結(jié)構(gòu)和組織層次。

1.2 淚腺類器官

近年來，利用再生醫(yī)學(xué)(包括多能干細(xì)胞的類器官)修復(fù)功能性淚腺的治療理念已成為治療重度干眼的考慮方向。

Bannier-Hélaou?t等[10]將類器官細(xì)胞及其對應(yīng)組織與單細(xì)胞測序技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)建了一個(gè)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)平臺。他們培育出源于小鼠和人的淚腺導(dǎo)管類器官，使用神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行刺激流淚，通過對組織和類器官的單細(xì)胞mRNA測序揭示淚腺的細(xì)胞異質(zhì)性。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：Pax6基因?qū)τ诰S持淚腺功能關(guān)鍵基因的表達(dá)和類器官的生長發(fā)育是必須的，對于淚腺發(fā)育有著不可或缺的作用。同時(shí)，通過對900多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序，檢測LTF、LCN1、LYZ、LACRT等多種蛋白的表達(dá)水平，該研究發(fā)現(xiàn)不同的淚腺細(xì)胞亞群表達(dá)不同的產(chǎn)物。此外，通過神經(jīng)遞質(zhì)的刺激還可以模擬流淚的過程，將人的類器官移植到小鼠體內(nèi)也可以基本發(fā)揮淚腺的功能。

Jeong等[11]著重探究淚腺類器官應(yīng)用于干眼器官替換治療的可行性。他們使用匹羅卡品處理，通過鈣內(nèi)流或蛋白質(zhì)組學(xué)分析證實(shí)淚腺類器官具有分泌功能。通過制備小鼠衍生的淚腺類器官并將其移植到干眼小鼠模型的淚腺組織中，最終證實(shí)小鼠淚腺類器官與在體正常淚腺組織特征相似，并可用于治療干眼。

1.3 視網(wǎng)膜類器官

視網(wǎng)膜類器官(retinal organoid，ROs)來自干細(xì)胞，在誘導(dǎo)因子作用下可自發(fā)形成三維組織結(jié)構(gòu)，與人體視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)非常相似，對移植治療和疾病建模領(lǐng)域是一大技術(shù)突破[12]。然而，ROs應(yīng)用在現(xiàn)階段仍存在各種缺陷，包括培養(yǎng)過程長、產(chǎn)量不足、不同條件下產(chǎn)生的ROs存在巨大異質(zhì)性等。具有里程碑的實(shí)驗(yàn)代表是Sasai實(shí)驗(yàn)室研究培養(yǎng)出的ROs，近年來，通過對Sasai實(shí)驗(yàn)的不斷優(yōu)化，人胚胎干細(xì)胞來源的ROs逐漸發(fā)展，縮短了視網(wǎng)膜類器官培養(yǎng)的時(shí)間[13-14]。

ROs有助于理解視網(wǎng)膜的發(fā)育生理和轉(zhuǎn)錄機(jī)制[15]。例如由甲狀腺激素調(diào)節(jié)的錐細(xì)胞分化機(jī)制已被闡明[16]。ROs模型還可研究不同基因在眼形成和神經(jīng)視網(wǎng)膜分化中的作用。ROs可用于觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞類型的動態(tài)轉(zhuǎn)錄過程，有絲分裂和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)減少，隨后依次形成錐細(xì)胞和桿細(xì)胞、Müller膠質(zhì)細(xì)胞[17]。

1.3.1 視網(wǎng)膜類器官的應(yīng)用

1.3.1.1 疾病模型

近年來，關(guān)于眼部疾病的ROs模型已經(jīng)相繼建立，既可以研究疾病的病理機(jī)制還可以用于治療。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)是兒童最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，傳統(tǒng)模型無法準(zhǔn)確模擬人類Rb的起源和發(fā)展，利用基因工程人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)建立的Rb器官模型與人類原發(fā)性Rb一致性高，可用于研究Rb的起源和發(fā)病機(jī)制[18]。盡管先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP[19])、RB、X連鎖視網(wǎng)膜劈裂癥(X-linked retinoschisis，XLRS)等模型已被建立并深入研究，利用ROs模型能發(fā)現(xiàn)各個(gè)疾病有相對應(yīng)的基因突變，但這項(xiàng)技術(shù)仍存在許多挑戰(zhàn)。由于ROs是相對不成熟的結(jié)構(gòu)，且缺乏視神經(jīng)、視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)和小膠質(zhì)細(xì)胞，建立晚期疾病的模型十分困難。Achberger等[20]將ROs與視網(wǎng)膜芯片中人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human inducedpluripotent stem cells，hiPSC)衍生視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)相結(jié)合，這種新型的微生理平臺能夠增強(qiáng)視網(wǎng)膜內(nèi)段和外段的形成和保存以及RPE和光感受器之間的直接相互作用，并且能夠精確地控制血流灌注，為基礎(chǔ)應(yīng)用研究提供了方向。

1.3.1.2 藥物研究

人類ROs技術(shù)有望比動物和二維模型更真實(shí)地模擬發(fā)育和疾病過程[21]，能夠應(yīng)用于臨床前藥物開發(fā)階段的靶向治療和藥物毒性評估，并取得了可觀的成果[22]。Ito等[23]研究發(fā)現(xiàn)維生素E相比葉黃素在保護(hù)視網(wǎng)膜退化上更有效。

1.3.1.3 移植治療

視網(wǎng)膜類器官可作為移植治療的細(xì)胞來源，近年來的大部分研究主要集中在光感受器視錐、視桿細(xì)胞，也有少部分關(guān)于Müller膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的研究[24-25]。根據(jù)目前多項(xiàng)研究結(jié)果，多能干細(xì)胞衍生出的RPE細(xì)胞治療年齡相關(guān)性黃斑病變(age-related macular degeneration，ARMD)和Stargard疾病安全且穩(wěn)定，為光感受器的移植安全提供了事實(shí)依據(jù)[26]。目前主要有兩種移植方法，分別為供體的細(xì)胞懸液和細(xì)胞層。McLelland等[27]使用健康視網(wǎng)膜組織來源的ROs治療免疫缺陷的晚期視網(wǎng)膜變性大鼠模型，研究表明移植的細(xì)胞層經(jīng)歷了分化和整合，盡管微環(huán)境退化，但其可以形成視錐視桿細(xì)胞、雙極細(xì)胞、Müller膠質(zhì)細(xì)胞、無長突細(xì)胞等等，進(jìn)而改善視功能。

CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)RP/XLRS模型的成功建立。成功構(gòu)建Crx-iCreERT2紅色熒光報(bào)告人ESCs系經(jīng)3D培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為表達(dá)tdTomato紅色熒光的視網(wǎng)膜類器官,得到的視網(wǎng)膜類器官同人類正常視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞組成一致且發(fā)育的時(shí)間和空間順序接近于正常的人類視網(wǎng)膜[28]。

1.3.1.4 基因治療

目前重組腺相關(guān)病毒(recombinant adenoassociated virus，rAVV)是在視網(wǎng)膜基因傳遞中最廣泛使用的基因擴(kuò)增的載體，是遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良性疾病靶向治療的一種方式?；颊邅碓吹腞Os可替代動物模型測試AAV介導(dǎo)的基因擴(kuò)增效率。最新研究的優(yōu)化AAV載體，可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)人類視網(wǎng)膜類器官[29]，成功解決了載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的問題。

1.4 晶狀體

Huang等[30]在1970s利用正常和白內(nèi)障小鼠的晶體初步研究探索晶狀體類器官。隨后Yang等[31]最先通過一系列的成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)抑制和激活通路培養(yǎng)步驟進(jìn)行“三階段”培養(yǎng)，成功從hESCs中培養(yǎng)出大量晶狀體祖細(xì)胞及三維晶狀體模型，但該模型誘導(dǎo)的晶狀體不能實(shí)現(xiàn)完全分化，且缺乏光聚焦能力。此后研究[32]發(fā)現(xiàn)：哺乳動物內(nèi)源性LECs具有修復(fù)和再生能力，能夠形成具有生物視覺功能的晶狀體，其中PAX6、BMI-1是維持LECs更新的重要因素。這一發(fā)現(xiàn)用于治療先天性白內(nèi)障，減少了并發(fā)癥，并對白內(nèi)障形成機(jī)制有更深一步的了解。

2017年，F(xiàn)u等[33]通過“煎蛋”分化方式將人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)為晶狀體祖細(xì)胞和類晶狀體小體，由于在其分化過程中的一個(gè)時(shí)期細(xì)胞呈煎蛋樣外觀而得名，其“蛋黃”為E鈣黏蛋白陽性分化細(xì)胞，最終形成類晶狀體小體，“蛋清”為E鈣黏蛋白陰性支持細(xì)胞。使用相同的方法[34]，能夠研究源于人胚胎干細(xì)胞和多能干細(xì)胞的類晶狀體小體的自噬活性，用以揭示細(xì)胞器降解產(chǎn)生的無細(xì)胞器區(qū)與白內(nèi)障的關(guān)系。目前，類晶狀體小體已經(jīng)可以被用于研究白內(nèi)障的各種病因，包括先天性白內(nèi)障和年齡相關(guān)性白內(nèi)障[35-36]。對于年齡相關(guān)性白內(nèi)障模型，觀察發(fā)現(xiàn)類晶狀體小體在長期培養(yǎng)后會有自發(fā)性渾濁和蛋白聚集，并且過氧化氫等氧化劑會加速該過程。

Murphy等[37]研究了一種新的分化方式，所形成的類晶狀體小體含有更少的非晶狀體細(xì)胞。與以往的模型相比，他們的模型產(chǎn)生了更多具有雙凸外觀的球形小晶狀體，并且具有更強(qiáng)的光聚焦能力。他們通過磁激活細(xì)胞分選法純化細(xì)胞，以選擇表達(dá)ROR1的細(xì)胞，研究后囊膜混濁。他們的模型可以有效地幫助理解白內(nèi)障多種危險(xiǎn)因素背后的潛在機(jī)制，并尋找治療靶點(diǎn)。

來源于LECs的晶狀體類器官能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)分化而成，不受體外環(huán)境的干擾，在一定條件下能夠再生出具有視覺功能的晶體，使白內(nèi)障手術(shù)有了大步飛躍。但LECs增殖能力與年齡成負(fù)相關(guān)，容易無序增長成渾濁的晶體。來源于ESCs的晶狀體類器官培養(yǎng)步驟復(fù)雜，先生成晶狀體祖細(xì)胞再形成三維晶狀體結(jié)構(gòu)，需要嚴(yán)格地化學(xué)體外培養(yǎng)環(huán)境，但具有更大的分化潛能，該模型對于研究人類晶狀體胚胎發(fā)育的分子機(jī)制及病理模型十分有用。

晶狀體類器官模型已被應(yīng)用于白內(nèi)障病理生理機(jī)制、藥物篩選評估、治療等方面。手術(shù)摘除是先天性白內(nèi)障的唯一治療方案，術(shù)中及術(shù)后并發(fā)癥多，尤其是發(fā)生炎癥、弱視、后囊下渾濁的概率高。目前通過使用患者特異性iPSC建立相應(yīng)的先天性白內(nèi)障疾病模型，發(fā)現(xiàn)近40種基因如CRYGD和CRYBB2突變可引起蛋白質(zhì)聚集晶體混濁。除遺傳背景外，晶狀體發(fā)育的微環(huán)境也對先天性白內(nèi)障發(fā)生起到重要作用，該模型也為臨床候選藥物篩選的研究提供了一個(gè)平臺[38]。通過對內(nèi)源性LECs的再生研究，一種新的微創(chuàng)白內(nèi)障手術(shù)方法保留了晶狀體囊和相關(guān)LECs的完整性，促進(jìn)了患者晶狀體再生，恢復(fù)了視力且術(shù)后并發(fā)癥少，在治療先天性白內(nèi)障方面取得了又一大突破。使用自然再生晶體治療白內(nèi)障的新策略是非?？扇〉腫32]。

2 微流控芯片

2.1 角膜芯片

角膜芯片技術(shù)仍處于初級階段，但是通過對角膜芯片模型進(jìn)行的簡單干預(yù)已經(jīng)能夠重現(xiàn)某些疾病的特征。2018年，Bennet等[39]所開發(fā)的角膜芯片含有上皮層、基底膜和前彈力層，并且在微流控裝置中模擬淚液流動。他們使用聚二甲硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜培養(yǎng)永生化的人角膜上皮細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)與無涂層或膠原涂層的膜相比，種植在纖維結(jié)合蛋白涂層膜上的細(xì)胞更具活性。這種模型的上皮滲透性與人體組織十分相似。他們使用強(qiáng)的松和酮替芬滴眼劑對其模型進(jìn)行了藥物研究，以評估其模型在藥物滲透性方面的功能，并發(fā)現(xiàn)與連續(xù)流動或靜態(tài)條件相比，脈動淚液流與人眼最為相似。然而，由于芯片缺少免疫系統(tǒng)，無法精確地模擬眼表的藥理學(xué)免疫調(diào)節(jié)作用，但能有效模擬非免疫過程。

Seo等[40]結(jié)合眼瞼、結(jié)膜和角膜設(shè)計(jì)的角膜芯片是一個(gè)重要突破，其設(shè)計(jì)的具有灌注系統(tǒng)和過量引流系統(tǒng)的穹頂狀支架，可以用于模擬淚液的分泌、排泄和眨眼過程。該芯片模擬角膜和結(jié)膜的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)，含有1層表達(dá)基底細(xì)胞特異性標(biāo)志物(p63)的細(xì)胞，且能分泌黏蛋白，維持眼表約6 μm厚的均勻淚膜。在這類模型中，眨眼的剪切力將有助于角膜上皮的生長分化，證明細(xì)胞生化網(wǎng)絡(luò)能對機(jī)械力進(jìn)行感知和反應(yīng)。通過減少眨眼頻率和調(diào)整環(huán)境濕度，加速淚液蒸發(fā)，可以直接構(gòu)建干眼模型。更重要的是，白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix mentalloproteinase 9，MMP-9)等炎癥細(xì)胞因子在該干眼模型中過量表達(dá)，與干眼在人體內(nèi)的反應(yīng)一致，因此可以用于模擬和研究干眼的機(jī)械和生物化學(xué)特征。使用內(nèi)源性潤滑素對該干眼模型進(jìn)行測試后發(fā)現(xiàn)，淚膜破裂時(shí)間延長，淚膜破裂面積減少，角膜熒光染色發(fā)生相應(yīng)改變，同時(shí)檢測到IL-8的TNF-α、IL-1β和MMP-9等炎癥因子的淚膜濃度分布明顯減少，與臨床試驗(yàn)結(jié)果相似。這項(xiàng)分析表明，角膜芯片既可以在臨床前實(shí)驗(yàn)階段進(jìn)行“臨床試驗(yàn)”，也可以在分子水平上揭示相應(yīng)治療藥物的治療原理。

角膜芯片與角膜類器官相比，更容易進(jìn)行相關(guān)干預(yù)，從而能更精確地模擬部分慢性眼部疾病，例如結(jié)膜炎或干眼等，并以更為具象的方式為疾病研究和藥物研發(fā)提供其實(shí)可靠的依據(jù)。

2.2 淚腺芯片

各種新型生物工程已被用于功能器官的再生，以模擬或治療相應(yīng)疾病。Lu等[41]針對干眼的治療評價(jià)和發(fā)病機(jī)制研究，建立了眼表體外三維共培養(yǎng)模型。該模型由兔結(jié)膜上皮和淚腺細(xì)胞球體組成，模擬淚膜的水樣層和黏蛋白層。結(jié)果顯示：與單一培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)提供了更具生理相關(guān)性的治療反應(yīng)，表明利用淚膜-眼表系統(tǒng)(包括淚腺球體和結(jié)膜上皮)的各種組織的共培養(yǎng)系統(tǒng)，可作為干眼和治療評價(jià)的模型。

2.3 視網(wǎng)膜芯片

由于視網(wǎng)膜芯片能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的多層排列以及類似血流的灌注，特別適用于模擬類器官所缺乏的血視網(wǎng)膜屏障(blood-retina barrier，BRB)，尤其是血視網(wǎng)膜外屏障(outer blood-retina barrier，oBRB)和微毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的相鄰脈絡(luò)膜微血管網(wǎng)絡(luò)。最簡單的oBRB芯片為雙通道微流控芯片，其中RPE和內(nèi)皮細(xì)胞種植在多孔膜的對側(cè)，隨后通過介質(zhì)泵進(jìn)行灌注以重建微血管血流。

此后，Chung等[42]采用纖維蛋白水凝膠間隙代替多孔膜。為了模擬三維脈絡(luò)膜血管網(wǎng)，將內(nèi)皮細(xì)胞與纖維蛋白凝膠混合后植入纖維蛋白間隙下方的通道中，將RPE(ARPE19)細(xì)胞接種于凝膠壁上。血管生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)刺激后，脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞浸潤纖維蛋白間隙和RPE層，再現(xiàn)了濕性老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)的發(fā)病過程。抗血管內(nèi)皮生長因子抗體貝伐單抗可以用于治療模擬的濕性AMD，其后續(xù)治療可防止血管增生，表明血-視網(wǎng)膜屏障芯片不僅能重現(xiàn)病理生理過程，而且能重現(xiàn)治療過程。

Yeste等[43]的芯片采用多層設(shè)計(jì)，由多個(gè)滲透膜分隔，整合了血視網(wǎng)膜內(nèi)外屏障和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，并驗(yàn)證了其屏障功能。Achberger等[20]開發(fā)的芯片對oBRB與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層一起建模，將所有主要的視網(wǎng)膜細(xì)胞類型結(jié)合在一個(gè)平臺上，并具有微流控灌注系統(tǒng)。通過施加抗瘧疾藥物氯喹和抗生素慶大霉素，能夠重現(xiàn)其對視網(wǎng)膜的毒副作用，證明了視網(wǎng)膜芯片在藥物測試中的適用性。這種基于人多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜芯片可能促進(jìn)藥物開發(fā)，是探究視網(wǎng)膜疾病潛在病理機(jī)制的新途徑。

視網(wǎng)膜芯片能夠模擬視網(wǎng)膜的生理過程和生理屏障，對藥物效應(yīng)的臨床前評估十分重要[44]。Achberger等[20]發(fā)現(xiàn)氯喹和慶大霉素對視網(wǎng)膜傷害性較大，RPE可能是藥物作用的生理屏障。視網(wǎng)膜芯片也被用于眼內(nèi)填充物的開發(fā)和測試，例如在視網(wǎng)膜脫離和巨大視網(wǎng)膜裂孔等疾病中測試硅油的填充量。近年來，更多的研究用來開發(fā)更先進(jìn)的視網(wǎng)膜芯片模型來模擬移植后視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞移植治療功能失調(diào)的效率主要依賴供體細(xì)胞共同遷移的正確方向[45]。Mishra等[46]研究發(fā)現(xiàn)：通過使用電場并提高基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal derived factor-1，SDF-1)，細(xì)胞的遷移距離和方向性都增強(qiáng)。光學(xué)相干斷層掃描、視覺動力學(xué)測試、免疫造血化學(xué)等方法可用于確定移植效果。

3 結(jié)語

工程化類器官和微流控芯片勢必會改變我們未來對眼睛進(jìn)行體外研究的方式。特別是，這些技術(shù)為我們研究疾病表現(xiàn)的個(gè)體差異提供了可能[47]。盡管最近取得了一些進(jìn)展，但仍有一些缺點(diǎn)和挑戰(zhàn)需要解決[48]。技術(shù)的多變性是類器官系統(tǒng)中的一個(gè)主要問題，需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化方案來避免不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)告結(jié)果的差異。同樣地，使用特性良好的商用多能干細(xì)胞系將有助于實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的闡述。此外，部分類器官和微流控芯片血管系統(tǒng)的缺乏也阻礙了糖尿病[49]、高血壓等全身性疾病在眼部組織的研究。而另一個(gè)重要的難題是對不同眼組織間建立相互作用的模型。角膜和視網(wǎng)膜芯片是體外研究藥物作用[50]、治療方法和疾病相關(guān)問題的有效工具，但是目前的芯片仍然過于簡單，可能無法重現(xiàn)機(jī)體復(fù)雜的內(nèi)分泌環(huán)境所導(dǎo)致的一系列功能變化，測試藥物的結(jié)果不一定完全可觀準(zhǔn)確。未來的發(fā)展可能會使這些芯片變得更加復(fù)雜，能夠越來越真實(shí)地反應(yīng)人眼的結(jié)構(gòu)和功能特征。

病毒性疾病和微生物組分析是類器官和微流控芯片用于眼科研究的2個(gè)重要領(lǐng)域。由于病毒與宿主相互作用的特殊性，通常很難在動物體內(nèi)模擬人類病毒性疾病。類器官由于其對組織的高度還原性，可以用于病毒學(xué)研究[51]。而微流控芯片技術(shù)提供了一種研究微生物與人體外不同組織之間直接相互作用的方法。在未來，眼部微生物組芯片技術(shù)有望成為眼表疾病病理生物學(xué)和臨床治療等領(lǐng)域的一個(gè)新途徑。

最后，只有開發(fā)相關(guān)的測量方法，從工程模型中提取生化和物理數(shù)據(jù)，才能充分發(fā)揮體外建模的潛力，而組織學(xué)技術(shù)的進(jìn)步在這方面發(fā)揮著重要作用。目前，生物學(xué)的分析研究與生物衍生工程共同發(fā)展，預(yù)示著類器官和微流控芯片在臨床轉(zhuǎn)化研究中的巨大潛力。

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