余紅喜，劉 帆，朱國美，任信林，劉鑫鑫，凌武海，蘇時萍*

(1.滁州市農業(yè)農村技術推廣中心,安徽滁州 239000；2.安徽農業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥 230036)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，隸屬甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬，俗稱小龍蝦。自20世紀30年代傳入我國，在長江流域擴繁[1]，其味道鮮美，高蛋白低脂肪[2]，生命力頑強，適應性廣，繁殖能力強，對水質要求不高，現已遍布于我國中東部地區(qū)十余省[3]，成為我國稻田養(yǎng)殖的主要品種，養(yǎng)殖面積總量大，產量居淡水蝦類之首[4]。由于近幾年克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積和規(guī)模不斷擴大，受其逆向選擇及種苗自繁自育的養(yǎng)殖模式等人為因素的影響，使得克氏原螯蝦個頭逐年變小，病害頻發(fā)，種質退化嚴重，群體遺傳多樣性受到嚴峻考驗[5]。為了恢復與保護克氏原螯蝦種質資源，提供優(yōu)良品種的選育科學依據，并提高經濟效益，研究克氏原螯蝦遺傳多樣性與遺傳結構至關重要。

線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是保守的共價閉合的雙鏈DNA分子，具有結構簡單、進化速度快、無重組、多拷貝、母系遺傳等特點。線粒體細胞色素氧化酶亞基I(COⅠ)作為蛋白編碼基因的一員，在分子標記上是研究最為清楚的線粒體基因之一，也有學者認為，相比其他線粒體基因，COⅠ基因是更為理想和常用的分子標記[6]。徐浩文等[7]分析了8個地理種群紅條毛膚石鱉COⅠ基因的遺傳多樣性，單倍型遺傳多樣性數據顯示，多樣性數值較高，核苷酸多樣性較低，結果表明，紅條毛膚石鱉北方群體的遺傳多樣性與南方群體存在差異，2個群體應該分別采取相應措施來保護遺傳多樣性；李大命等[8]基于線粒體COⅠ基因序列分析江蘇省4個太湖新銀魚群體遺傳多樣性，結果表明4個太湖新銀魚種群偏離中性進化，歷史上經歷過種群擴張；劉士力等[9]分析了紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體線粒體COⅠ基因序列的遺傳結構，結果表明，5個紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性存在差異，群體間存在著一定的基因交流；軒中亞等[10]基于線粒體COⅠ序列分析中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體與野生群體遺傳多樣性與遺傳結構，發(fā)現野生中華絨螯蟹遺傳多樣性較低，尤其是在長江水系，不同地理群體之間的種質混雜情況較為嚴重，反映了過度捕撈對種質資源的極大破壞。然而，有關克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體線粒體COⅠ基因序列遺傳多樣性的研究鮮見報道。

安徽省滁州市稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦至今已有25年，養(yǎng)殖群體分布廣泛，也是最早開展克氏原螯蝦苗種繁育的地區(qū)之一，以該地區(qū)為代表，研究克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性具有良好的代表性。筆者基于線粒體COⅠ基因序列，分析了安徽滁州市8個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結構，探究其養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性現狀，為更高效地開發(fā)利用安徽省克氏原螯蝦種質資源及開展種質資源評估提供參考依據和科學指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料樣品采自安徽省滁州市，分別為全椒縣潘氏生態(tài)農業(yè)發(fā)展有限公司(F1)、全椒縣赤鎮(zhèn)龍蝦經濟合作社(F2)、全椒縣金順家庭農場(F3)、全椒縣銀花家庭農場(F4)、定遠縣曹永明家庭農場(F5)、定遠錦鴻種養(yǎng)殖專業(yè)合作社(F6)、定遠縣成海家庭農場定遠成海生態(tài)農場(F7)、定遠縣許令國生態(tài)種養(yǎng)殖家庭農場(F8)，共8個群體200個樣本。取其背部肌肉組織置于95%乙醇中，4 ℃保存，用于線粒體DNA抽提。

1.2 試驗方法

1.2.1線粒體DNA的抽提。肌肉組織使用YEASEN動物組織直接PCR試劑盒抽提DNA，-20 ℃保存。

1.2.2COⅠ序列的擴增、測序。COⅠ引物序列[11]：LCO1490:5′-GGTCAA CAAATCATAAAGATATTGG -3′;HC02198:5′- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA -3′，委托上海桑尼生物科技有限公司進行引物合成。 PCR反應體系為40 μL，包括2×Tissue Direct PCR Mix 20 μL，20 mol/L上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補足至 40 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)；最后一個循環(huán)結束后，72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產物經凝膠電泳初步確定片段長度后，由上海桑尼生物科技有限公司進行產物純化、測序。

1.2.3遺傳多樣性和群體分化分析。序列的比對、堿基組成、遺傳距離使用MEGAX[12]進行分析。序列的變異位點、核苷酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd)、分化系數(FST)使用DNAsp 5.0[13]進行分析。

1.2.4群體結構分析。單倍型網絡圖使用POPART[14]構建。鄰接法系統(tǒng)進化樹使用MEGAX[12]構建，并進行1 000次的Bootstrap檢驗。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性和群體分化分析COⅠ測序數據經人工校正、比對、去除兩端冗余序列和BLAST驗證序列同源性后，共獲得182條長度為655 bp的COⅠ序列用于下游分析，182條序列共檢出25個變異位點，包括15個簡約信息位點和10個單堿基變異位點；堿基平均含量為T(40.0%)，C(13.0%)，A(27.0%)和G(20.0%)，具有明顯的(A+T)堿基偏倚。遺傳多樣性分析顯示(表1)，多數群體具有較低的單倍型多樣性(0.13 ～0.41 < 0.50)，僅F7組擁有較高的單倍型多樣性(Hd=0.82)。核苷酸多樣性與單倍型多樣性趨勢一致，但所有群體均較低?？傮w來說，8個群體整體呈現低單倍型多樣性及低核苷酸多樣性的遺傳多樣性現狀。

表1 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數

群體分化分析顯示(表2)，8個養(yǎng)殖群體間發(fā)生了不同程度的分化，從輕微分化(FST<0.05)到中等分化(0.05

表2 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的FST(對角線下)與群體間遺傳距離(對角線上)

2.2 群體結構分析鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示(圖1)，個體并未按照養(yǎng)殖群體地理位置分布聚集成相應的分支，反而混雜在一起，且個體間遺傳距離較近。單倍型網絡圖顯示(圖2)，共檢出26種單倍型，其中，Hap_1、Hap_2、Hap_4、Hap_7、Hap_15為多群體共享單倍型；Hap_2在群體共享單倍型中占主要分布，其余均為群體內獨有單倍型；F7組群體擁有最多的單倍型(12個)。單倍型的分布方式與系統(tǒng)發(fā)育樹趨勢相同，并未依據地理位置而聚集，而是通過Hap_2替換數個堿基后相連接，多數單倍型為群體內部獨有。

圖1 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹

注：圓圈面積大小代表單倍型頻數，不同的顏色代表不同的群體，豎線代表突變位點

3 討論

3.1 序列特征與遺傳多樣性分析COⅠ基因進化速度快，引物通用性強，堿基替換速率快，被廣泛應用于群體遺傳變異及系統(tǒng)進化等研究[15]。該研究共獲得8個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體182條，COⅠ區(qū)序列約為655 bp。堿基T、C、A、G 的平均含量為T(40.0%)，C(13.0%)，A(27.0%)和G(20.0%)，其中A+T(67.0%)高于C+G(33.0%)，呈現明顯的AT堿基偏倚，符合脊椎動物線粒體堿基構成的一般特征[16]。

遺傳多樣性是生物適應與進化的物質基礎，用于評價物種進化潛能與健康狀況，豐富的遺傳多樣性使得物種能夠更好地適應環(huán)境，擁有巨大的進化潛力。人工養(yǎng)殖的動物常因親本基數不足，難以避免近交，產生奠基者效應，加速遺傳漂變，使得遺傳多樣性迅速丟失。核苷酸多樣性指數和線粒體DNA 的單倍型多樣性指數是衡量DNA 多態(tài)程度的2個重要指標。8個群體的遺傳多樣性指數表現為較低的單倍型多樣性(Hd=0.37)與較低的核苷酸多樣性(Pi=0.001 72)，表明滁州地區(qū)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較低，需要改良育種措施和育種方法。

3.2 遺傳分化和群體結構群體間的遺傳距離是衡量群體遺傳分化的重要指標[17]。利用遺傳距離數值定量估計了物種不同分類單位間的遺傳分化水平，種群間遺傳距離值為0～0.05，亞種間是0.02～0.20。該研究中8個克氏原螯蝦群體間的遺傳距離均在0.05 以下，且 MGEA軟件聚類分析發(fā)現，8個群體均為混合聚類，說明8個群體之間的遺傳分化處于群間水平。

群體遺傳學研究認為，FST值可以表示群體間的分化程度，根據Wright[18]的劃分標準可分為：0～0.05，無分化；>0.05～0.15，中度分化；>0.15 ～ 0.25，高度分化；>0.25，重度分化。該研究8個群體間的FST為-0.023 56～ 0.122 14，F7組與F1組群體間的遺傳分化系數為0.122 14，表現為中度遺傳分化；F6組與F8組群體間分化最弱。同樣地，在單倍型網絡圖顯示出與系統(tǒng)進化樹相似的結果，8個群體的單倍型并未依照地理位置聚集，反而以Hap_2為主要共享單倍型，其余單倍型通過數個堿基的替換演變成群體內部獨有單倍型。

4 結論

綜上所述，該研究基于能夠反映種群間遺傳多樣性的線粒體COⅠ為分子標記，分析了8個安徽省滁州市克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結構。結果表明，8個群體的遺傳多樣性較低，群體結構為輕微程度的分化，群體間遺傳 距離較小，不足以認定為群體間有差異。因此，在后續(xù)的繁殖與選育工作中，應當加強對遺傳背景的篩查，避免因遺傳背景的相似，造成克氏原螯蝦遺傳多樣性的進一步丟失，進而影響克氏原螯蝦養(yǎng)殖的經濟效益。