王 倩，吳 嫻，劉玉薇，吳朝昕，李祖軍，龔記熠，朱速松*

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550001；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研宄所，貴州貴陽(yáng) 550006；3.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025)

水稻是唯一能在無(wú)氧環(huán)境下萌發(fā)的谷類(lèi)作物[1]，在水淹環(huán)境下雜草能夠得到一定程度的控制。當(dāng)水稻種子遭受水淹時(shí)，氧氣濃度過(guò)低，種子在進(jìn)行有氧呼吸時(shí)直接受制，造成出苗率下降[2]。已有研究表明，水稻種子在水淹環(huán)境中萌發(fā)時(shí)，其胚芽鞘的長(zhǎng)度與耐淹成苗率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系[3-5]。因此，水稻在受到水淹的惡劣環(huán)境下萌發(fā)時(shí)，挑選出苗能力強(qiáng)的耐淹性水稻品種對(duì)水稻的安全生產(chǎn)具有重要意義。

在水稻水淹試驗(yàn)中，不同品種、環(huán)境和處理方法下的胚芽鞘長(zhǎng)度存在不同程度的變異[6]，屬于多基因控制的數(shù)量性狀[7]。學(xué)者們選取不同群體進(jìn)行耐淹性狀QTL研究，定位到的位點(diǎn)存在一定差別，如侯名語(yǔ)等[4]利用Kinmaze/DV85 RIL群體分別在第1、2、5、7號(hào)染色體上檢測(cè)到耐淹性QTLs,貢獻(xiàn)率在10.5%～19.6%。Jiang等[8]利用秈稻與粳稻雜交F2群體定位到2個(gè)相關(guān)QTL，分布在第5、11號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率分別為15.51%和10.99%。王洋等[9]利用粳粳交RIL群體定位到2個(gè)相關(guān)QTLs，又利用秈粳交BIL群體定位到6個(gè)相關(guān)QTLs。Angaji等[10-11]以IR64為輪回親本構(gòu)建2個(gè)不同的BIL群體,用區(qū)間作圖(IM)和復(fù)合區(qū)間作圖(CIM)2種方法進(jìn)行比較，在其中一個(gè)BIL群體中的9號(hào)染色體上定位到一個(gè)位點(diǎn)qAG-9-2, 該位點(diǎn)貢獻(xiàn)率為20.59%。與此同時(shí)，與耐淹性狀有關(guān)的基因也被成功克隆，如位于第2染色體上的OsABA8ox1基因[12]，位于第3染色體上的OsETOL1基因[13]和OsMPK3基因[14]，以及第9染色體上的Sub1A基因[15]。筆者以貴9B和熱研2號(hào)為親本構(gòu)建的秈粳交遺傳背景RIL，以胚芽鞘長(zhǎng)度為表型數(shù)據(jù)，對(duì)控制水稻耐淹性狀進(jìn)行QTL定位分析，篩選和創(chuàng)制耐淹種質(zhì)，旨在為主效基因的克隆和育種應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料選取粳稻品種熱研2號(hào)作母本，秈稻品種貴9B作父本，雜交后獲得F1，自交后采用單粒傳法在貴陽(yáng)、海南兩地連續(xù)重組自交，穩(wěn)定后得到100個(gè)重組自交系群體家系。

1.2 田間種植將100個(gè)重組自交系群體家系及2個(gè)親本于2020年5月播種于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所試驗(yàn)田中。每個(gè)家系種植4行,每行10株，規(guī)劃密度為寬行35 cm,窄行25 cm，株距為20 cm，所有材料管理方式均為常規(guī)田間管理。

1.3 水淹條件下種子萌發(fā)將構(gòu)建的RILs群體以及對(duì)應(yīng)親本成熟后的種子分別于9月和10月以行中單株收取。種子曬干后脫粒,置于鼓風(fēng)干燥箱中38 ℃處理2 d，-20 ℃貯存?zhèn)溆?。從每個(gè)株系中挑選出20粒飽滿(mǎn)、干燥、無(wú)病種子，用6% NaClO 浸泡種子15 min，再用純凈水沖洗3～4次，使NaClO無(wú)殘留。使用純凈水淹沒(méi)種子，使其浸泡24 h后換1次水，再繼續(xù)浸泡24 h。待種子打破休眠后，將其放入光照培養(yǎng)箱中催芽，溫度設(shè)定為37 ℃，時(shí)間為48 h。挑選出發(fā)芽情況相同的種子各12粒，分別置于6支相同規(guī)格的試管中，每支試管底部裝入4粒種子，加入20 mL去離子水，用試管塞密封試管口，放置在27 ℃適溫黑暗條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)7 d,并設(shè)置3次重復(fù)。品種比較分析和QTL檢測(cè)的表型值為3次重復(fù)計(jì)算出的胚芽鞘長(zhǎng)度平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)種子出箱后,使用毫米刻度尺測(cè)定每一株系每一株幼苗萌發(fā)的胚芽鞘長(zhǎng)度，利用 Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和直方圖的繪制。

1.5 葉片DNA提取和遺傳圖譜的構(gòu)建從田間收取成熟的葉片組織后，使用CTAB法提取DNA。用覆蓋水稻全基因組的SSR標(biāo)記共661對(duì)，在親本貴9B和熱研2號(hào)之間進(jìn)行多態(tài)性篩選，最終篩選出161對(duì)SSR引物以及3對(duì)InDel引物多態(tài)性良好且在基因組上分布均勻的分子標(biāo)記，篩選出的引物用來(lái)分析RIL群體基因型。圖譜構(gòu)建采用ICI Mapping 4.2軟件，將軟件中的“sdl”作圖模塊中的“SAM ”分析方法作為偏分離檢測(cè)，其中LOD值設(shè)置為2.5，用以分析作圖所用標(biāo)記的偏分離情況，在圖譜中只檢測(cè)到1個(gè)占總標(biāo)記數(shù)0.6%顯著偏分離標(biāo)記，說(shuō)明該圖譜適用于QTLs檢測(cè)。

1.6 QTL分析QTL分析采用ICI Mapping 4.2軟件中的完備區(qū)間作圖法(ICIM),掃描步長(zhǎng)(walk speed)為1.0 cM，逐步回歸標(biāo)記進(jìn)入概率PIN為 0.001，LOD閾值確定為2.5。RILs群體中加性效應(yīng)值為正，說(shuō)明增效等位基因來(lái)源于親本熱研2號(hào)；加性效應(yīng)值為負(fù)，說(shuō)明增效等位基因來(lái)源于親本貴9B。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親和 RILs 群體在淹水條件下胚芽鞘表型數(shù)據(jù)2個(gè)親本以及100個(gè)重組自交系群體家系在淹水條件下黑暗生長(zhǎng)7 d后進(jìn)行表型測(cè)定，其中親本貴9B在淹水環(huán)境下生長(zhǎng)7 d后胚芽鞘長(zhǎng)度為1.427 cm，親本熱研2號(hào)胚芽鞘長(zhǎng)為1.999 cm。該RILs 群體在淹水條件下生長(zhǎng)7 d后，其胚芽鞘長(zhǎng)變幅為0.793～2.801 cm，峰度0.163，偏度0.521。胚芽鞘長(zhǎng)度數(shù)據(jù)接近正態(tài)分布(圖1)，耐淹性狀表現(xiàn)出受多基因控制的數(shù)量性狀特征。

圖1 貴9B/熱研2號(hào)RILs耐淹條件下生長(zhǎng)7 d后的胚芽鞘長(zhǎng)度分布

2.2 RILs耐淹性狀QTL分析利用ICI Mapping 4.2軟件中的完備區(qū)間作圖法(ICIM)模塊對(duì)貴 9B和熱研2號(hào)的RILs群體進(jìn)行耐淹性狀QTL分析，在第6和第9染色體上檢測(cè)到2個(gè)控制耐淹性狀的QTL位點(diǎn)，分別將其命名為qGS-6-1和qGS-9-1，對(duì)應(yīng)位置和遺傳效應(yīng)見(jiàn)表1。qGS-6-1位于第6染色體標(biāo)記 RM345 與RM461遺傳距離10.14 cM之間，LOD值為2.89，貢獻(xiàn)率12.03%，加性效應(yīng)為負(fù)，等位基因來(lái)源于親本貴9B；qGS-9-1位于第9染色體標(biāo)記RM257與RM566遺傳距離13.15 cM之間，LOD值為2.51，貢獻(xiàn)率10.52%，加性效應(yīng)為正，等位基因來(lái)源于親本熱研2號(hào)(表1、圖2)。

注：a.RILs耐淹性狀QTL定位在第6染色體上的分布;b.RILs耐淹性狀QTL定位在第9染色體上的分布

表1 水稻耐淹性狀QTL定位

3 討論

由于種植地區(qū)的環(huán)境差異，當(dāng)種子播種在遭受氣候及水災(zāi)等惡劣環(huán)境影響時(shí)，急劇減少的氧氣濃度導(dǎo)致水稻的出苗率嚴(yán)重下降，使直播稻的生展受到限制[16]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,種子的耐淹性狀在不同品種之間存在著差異[17-19]，直播稻生產(chǎn)中提高種子出苗率的關(guān)鍵是選擇耐淹能力強(qiáng)的品種，Sub1A基因是一個(gè)通過(guò)QTL定位克隆得到的控制水稻耐淹性狀的QTL基因，因此,篩選耐淹性強(qiáng)的種質(zhì)資源,挖掘新的耐淹性狀基因,并解釋其耐淹機(jī)制是克服直播出苗率低的有效途徑。

該研究利用貴9B/熱研2號(hào)構(gòu)建重組自交系群體，并對(duì)水稻耐淹性狀進(jìn)行QTL定位分析，共檢測(cè)到2個(gè)耐淹性狀相關(guān)QTL，分別定位在第6和第9染色體上，貢獻(xiàn)率分別為12.03%和10.52%。qGS-6-1的標(biāo)記區(qū)間在RM345～RM461，在GRAMENE網(wǎng)站(https://archive.gramene.org/)進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與饒玉春等[20]在第6染色體上定位到的耐淹QTL(RM528～SBE1)有重疊部分，說(shuō)明該區(qū)間可能存在一個(gè)穩(wěn)定控制水稻耐淹性狀的位點(diǎn)。由于Sub1基因是一個(gè)已知的耐淹基因，同時(shí)也分布在第9染色上[15]，將qGS-9-1(RM257～RM566)與Sub1(RZ698～C1232)的物理位置比較后發(fā)現(xiàn)，Sub1與該研究的qGS-9-1位點(diǎn)不同，物理距離相差較遠(yuǎn)，推測(cè)qGS-9-1所在區(qū)間內(nèi)有一個(gè)潛在的耐淹性狀相關(guān)QTL位點(diǎn)。同時(shí)，將qGS-9-1與孫廣志等[21]在第9條染色體處檢測(cè)到的耐淹QTLqGS9比較后發(fā)現(xiàn)，qGS-9-1位點(diǎn)與qGS9位點(diǎn)相近，說(shuō)明該位點(diǎn)在不同環(huán)境及群體中的表達(dá)較穩(wěn)定。根據(jù)該研究檢測(cè)到的2個(gè)耐淹性QTL，可為下一步通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇方法選育耐淹性狀優(yōu)良的品種創(chuàng)造條件，也為水稻耐淹新品種的培育提供了重要的親本資源、基因資源以及標(biāo)記資源，同時(shí)也對(duì)優(yōu)良耐淹品種的選育提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

該研究利用貴9B/熱研2號(hào)構(gòu)建RILs，對(duì)該群體的耐淹性狀進(jìn)行QTL定位，最終在第6和第9染色體上定位到2個(gè)控制耐淹性狀的QTL，分別是qGS-6-1和qGS-9-1，貢獻(xiàn)率分別為12.03%和10.52%。與前人的研究比較發(fā)現(xiàn)，已有研究中的部分位點(diǎn)與該研究中的位點(diǎn)有重疊或相近部分，說(shuō)明該研究結(jié)果能夠穩(wěn)定表達(dá)。綜上所述，該研究中定位的QTL位點(diǎn)可為分子輔助育種奠定基礎(chǔ)，篩選出耐淹性狀的材料和克隆出耐淹新基因是水稻直播提高育種效率的關(guān)鍵。