安依凡，李 斌，張宗錦，楊章明，陳壽明，閆芳芳，安德榮*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒和資源微生物實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.中國(guó)煙草總公司四川省公司，四川成都 610000；3.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川攀枝花 617000)

富集培養(yǎng)微生物的意義主要包括獲得相當(dāng)數(shù)量的目標(biāo)微生物進(jìn)而制作微生物劑，用以改良土壤生物與防治病害[1]；也包括獲得相當(dāng)數(shù)量的微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)而制作化學(xué)劑，用以制藥[2]、保健品[3]等；還可以包括明確益生元進(jìn)而制作益生元微生物助劑，用以改善宿主健康[4]。芽孢桿菌是一類能產(chǎn)生內(nèi)生孢子的細(xì)菌，芽孢桿菌形成的孢子具有很強(qiáng)的耐高溫、抗干旱特征，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)植物保護(hù)領(lǐng)域。芽孢桿菌LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物可以作為芽孢桿菌固體粉劑生產(chǎn)過程中的接種劑，也可以作為液體水劑生產(chǎn)過程中的待放大環(huán)節(jié)。綜述西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒和資源微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)4株芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌1號(hào)、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5、解淀粉芽孢桿菌YF-6的研究結(jié)果，旨在為其開發(fā)利用提供參考。

1 4種芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用

1.1 4種芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)1835年Ehrenberg發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌，并將其命名為“Vibriosubtilis”。1872年隨著細(xì)菌分類系統(tǒng)的建立，Cohn又將其命名為“Bacillussubtilis”?？莶菅挎邨U菌隸屬于芽孢桿菌科芽孢桿菌屬，作為芽孢桿菌科的模式菌株，菌體呈桿狀，無莢膜，周生鞭毛能運(yùn)動(dòng)，是自然界中廣泛存在的革蘭氏陽性菌[5]。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)首先由日本學(xué)者Fukomoto于1943年發(fā)現(xiàn)并提出，他發(fā)表了分泌淀粉酶細(xì)菌的分離及分布的研究報(bào)告，報(bào)告指出解淀粉芽孢桿菌可以分泌細(xì)菌淀粉酶。英國(guó)學(xué)者Priest等[6]于1987年證明了Bacillusamyloliquefaciens這一名稱的有效性并指出Bacillusamyloliquefaciens的參照菌株為ATCC 23350。

2005年，西班牙科學(xué)家Ruiz-García等[7]從西班牙南部馬拉加貝萊斯河采集的苦咸水樣品中分離得到2個(gè)菌株CR-14b和CR-502T，它們能夠合成大量的脂肽類物質(zhì)并產(chǎn)生抗菌活性。Ruiz-García將其命名為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)并在IJSEM(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology《國(guó)際系統(tǒng)與進(jìn)化微生物學(xué)期刊》)上合格發(fā)表。

2010年，來自韓國(guó)忠北大學(xué)和新加坡國(guó)立大學(xué)的學(xué)者M(jìn)unusamy Madhaiyan從水稻的根際土壤分離出了細(xì)菌CBMB205，并觀察到它的運(yùn)動(dòng)。該細(xì)菌革蘭氏染色呈陽性，嚴(yán)格需氧，桿狀有鞭毛，具內(nèi)生孢子，在30 ℃、pH 7.0環(huán)境下添加600 mmol/L甲醇的AMS營(yíng)養(yǎng)基培養(yǎng)下它的生長(zhǎng)達(dá)到最佳。該細(xì)菌被鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)[8]。

1.2 4種芽孢桿菌不同菌株的應(yīng)用枯草芽孢桿菌Y25能夠降低百合枯萎病發(fā)病率[9]，枯草芽孢桿菌Bv17能夠大幅度降低非洲菊根腐病病情指數(shù)[10]，枯草芽孢桿菌Bs-15能夠較好防治柿樹炭疽病[11](微生物劑)；枯草芽孢桿菌8-2可以產(chǎn)出γ-聚谷氨酸[12]，枯草芽孢桿菌M364可以產(chǎn)出抗菌肽Bacillomycin D[13](化學(xué)劑)；枯草芽孢桿菌ACCC11025在0.8 mg/mL白術(shù)多糖助劑下顯著增殖[14]，枯草芽孢桿菌KCTC 2217在低聚果糖(fructooligosaccharide)助劑下可使日本鰻鱺顯著增重[15](益生元微生物助劑)。

解淀粉芽孢桿菌CRJ-9能夠有效控制辣椒疫病的發(fā)生和蔓延[16]，解淀粉芽孢桿菌Ba168能夠突出防治棉花黃萎病[17](微生物劑)；解淀粉芽孢桿菌HRH317可以產(chǎn)出抗菌蛋白[18]，解淀粉芽孢桿菌Y11可以產(chǎn)出淀粉酶[19]，解淀粉芽孢桿菌Tu-115可以產(chǎn)出纖維素酶[20](化學(xué)劑)。

貝萊斯芽孢桿菌S6能夠較好防治番茄早疫病[21]，貝萊斯芽孢桿菌WK1對(duì)水稻紋枯病的防治效果穩(wěn)定(與5%井岡霉素水劑防效相當(dāng))[22]，貝萊斯芽孢桿菌TCS001可顯著抑制黃瓜灰霉病病斑生長(zhǎng)并能顯著降低黃瓜白粉病病情指數(shù)[23](微生物劑)；貝萊斯芽孢桿菌DH82可以產(chǎn)出抗菌粗蛋白[24]，貝萊斯芽孢桿菌P9可以產(chǎn)出纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶[25](化學(xué)劑)。

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌MY1能夠很好預(yù)防和治療番茄灰霉病且與對(duì)照試劑腐霉利防效間沒有顯著差異[26]，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌265ZY3可作為復(fù)配菌肥菌種良好預(yù)防馬鈴薯干腐病[27](微生物劑)；甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BM47可以產(chǎn)出羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)[28]，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌DCS1可以產(chǎn)出堿性淀粉酶(alkaline amylase)、生物表面活性劑(biosurfactant)[29](化學(xué)劑)。

2 4株芽孢桿菌形態(tài)及其應(yīng)用特性數(shù)據(jù)

2.1 4株芽孢桿菌的菌株形態(tài)該實(shí)驗(yàn)室的芽孢桿菌菌株有4種：枯草芽孢桿菌1號(hào)、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5和解淀粉芽孢桿菌YF-6，菌株形態(tài)如圖1所示。

圖1 4株芽孢桿菌的菌株照片

枯草芽孢桿菌1號(hào)斜面底部褶皺較多，褶皺呈包圍狀；表面均勻，沙灘黃色；挑起時(shí)比較容易，濕度小。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6斜面底部褶皺非常多，褶皺呈放射狀；表面布有垂直于生長(zhǎng)方向的褶皺，暖灰色；挑起時(shí)局部完整性較高。貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5斜面底部褶皺較少，菌落易在菌株生長(zhǎng)輪廓處積累；表面不夠均勻，土黃色；挑起時(shí)易與培養(yǎng)基粘連。解淀粉芽孢桿菌YF-6斜面底部褶皺較少，菌株邊沿光滑無積累；表面均勻且易反光，奶白色；挑起時(shí)黏稠但局部完整性較差。

2.2 4株芽孢桿菌的應(yīng)用特征數(shù)據(jù)枯草芽孢桿菌1號(hào)能夠減少作物土傳病害、提高作物成活率、改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)、抑制有害菌。枯草芽孢桿菌是該實(shí)驗(yàn)室的研究方法模板菌株。

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6對(duì)番茄灰霉病菌、稻瘟病菌有較強(qiáng)生防效果，LB液體培養(yǎng)基無菌發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率為95.34%，EC50為10.18 mL/L；對(duì)稻瘟病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率為92.56%，EC50為10.84 mL/L；LB液體培養(yǎng)基無菌發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)抑制率為93.98%，EC50為2.03 mL/L；對(duì)稻瘟病菌的孢子萌發(fā)抑制率為92.09%，EC50為2.67 mL/L[30]。

貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5對(duì)一些作物真菌病菌有較好的抑菌帶寬，對(duì)棉花枯萎病菌抑菌帶寬為(15.1±0.1)mm、對(duì)西瓜炭疽病菌抑菌帶寬為(11.97±0.15)mm、對(duì)馬鈴薯早疫病菌抑菌帶寬為(11.43±0.59)mm、對(duì)玉米大斑病菌抑菌帶寬為(11.40±0.53)mm。貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5對(duì)煙草K326赤星病相對(duì)防效可達(dá)(77.78±5.75)%。

解淀粉芽孢桿菌YF-6對(duì)一些作物病菌也有較好的抑菌帶寬，對(duì)辣椒疫霉病菌抑菌帶寬為(7.04±0.26)mm、對(duì)蘋果炭疽病菌抑菌帶寬為(10.54±0.26)mm、對(duì)棉花枯萎病菌抑菌帶寬為(9.64±0.35)mm、對(duì)玉米大斑病菌抑菌帶寬為(10.45±0.42)mm。9×106cfu/mL的解淀粉芽孢桿菌YF-6的LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵液可以有效防止延安1號(hào)煙草赤星病的發(fā)生，且對(duì)延安1號(hào)煙草有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。

2.3 4株芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線枯草芽孢桿菌1號(hào)的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線可以分為遲緩期、增多適應(yīng)期、快速增多期、穩(wěn)定增多期、穩(wěn)定期5個(gè)階段。由圖2可知，生長(zhǎng)曲線在2～14 h，菌量無明顯增多，為遲緩期；在14～22 h，菌量增多先快后慢，為增多適應(yīng)期；在22～32 h，菌量增多快速，為快速增多期；在32～60 h，菌量穩(wěn)定增多，為穩(wěn)定增多期；在60～96 h，菌量無明顯變化，為穩(wěn)定期。生長(zhǎng)曲線在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.095 8；在穩(wěn)定期的72 h達(dá)到最大值，最大值為2.156。選擇快速增多期推算世代時(shí)間T，經(jīng)計(jì)算，T枯草芽孢桿菌1號(hào)=2.17 h。

圖2 4株芽孢桿菌的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線也可以分為遲緩期、增多適應(yīng)期、快速增多期、穩(wěn)定增多期、穩(wěn)定期5個(gè)階段。由圖2可知，生長(zhǎng)曲線在2～12 h，菌量無明顯增多，為遲緩期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，為增多適應(yīng)期；在22～32 h，菌量增多快速，為快速增多期；32～52 h，菌量穩(wěn)定增多，為穩(wěn)定增多期；在52～96 h，菌量無明顯變化，為穩(wěn)定期。生長(zhǎng)曲線在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.087 5；在穩(wěn)定期的56 h到達(dá)最大值，最大值為2.279。選擇快速增多期推算世代時(shí)間T，經(jīng)計(jì)算，T甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6=2.24 h。

貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線同樣可以分為遲緩期、增多適應(yīng)期、快速增多期、穩(wěn)定增多期、穩(wěn)定期5個(gè)階段。由圖2可知，生長(zhǎng)曲線在2～12 h，菌量無明顯增多，為遲緩期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，為增多適應(yīng)期；在22～28 h，菌量增多快速，為快速增多期；28～56 h，菌量穩(wěn)定增多，為穩(wěn)定增多期；在56～96 h，菌量無明顯變化，為穩(wěn)定期。生長(zhǎng)曲線在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.105 2；在穩(wěn)定期的56 h到達(dá)最大值，最大值為2.049。選擇快速增多期推算世代時(shí)間T，經(jīng)計(jì)算，T貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5=3.96 h。

與前3株芽孢桿菌相同，解淀粉芽孢桿菌YF-6的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線可以分為遲緩期、增多適應(yīng)期、快速增多期、穩(wěn)定增多期、穩(wěn)定期5個(gè)階段。生長(zhǎng)曲線在2～12 h，菌量無明顯增多，為遲緩期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，為增多適應(yīng)期；在22～32 h，菌量增多快速，為快速增多期；在32～52 h，菌量穩(wěn)定增多，為穩(wěn)定增多期；在52～96 h，菌量無明顯變化，為穩(wěn)定期。生長(zhǎng)曲線在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.090 2；在穩(wěn)定期的84 h到達(dá)最大值，最大值為2.355。選擇快速增多期推算世代時(shí)間T，經(jīng)計(jì)算，T解淀粉芽孢桿菌YF-6=2.68 h。

4株芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期末期參數(shù)如表1所示。

表1 4株芽孢桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期末期OD600吸光度值

3 結(jié)語

抑菌譜顯示甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6、解淀粉芽孢桿菌YF-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5對(duì)作物真菌性病害病原菌均有良好的拮抗作用。在煙草病害防治方面，枯草芽孢桿菌1號(hào)、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6已投入煙草黑脛病、煙草根黑腐病等煙草根莖類病害的防治工作，解淀粉芽孢桿菌YF-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5已投入煙草赤星病病害的防治工作。

根據(jù)發(fā)酵生長(zhǎng)曲線和對(duì)發(fā)酵現(xiàn)象的觀察，推測(cè)以獲得微生物劑為目標(biāo)的發(fā)酵適宜在純凈且活躍的快速增多期取樣，以獲得化學(xué)劑為目標(biāo)的發(fā)酵可以在復(fù)雜且強(qiáng)烈的穩(wěn)定期取樣；對(duì)以獲得微生物助劑為目標(biāo)的發(fā)酵，建議在明確益生元的前提下，改良營(yíng)養(yǎng)基?？莶菅挎邨U菌1號(hào)、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5、解淀粉芽孢桿菌YF-6均有發(fā)酵遲緩期、增多適應(yīng)期、快速增多期、穩(wěn)定增多期和穩(wěn)定期?？焖僭龆嗥诩?xì)菌的代謝活性、酶活性高而穩(wěn)定，大小比較一致，生活力強(qiáng)，因而廣泛地在生產(chǎn)上被用作“種子”和在科研上作為理想的試驗(yàn)材料。找出4株芽孢桿菌的快速增多期對(duì)生產(chǎn)過程中的接種環(huán)節(jié)有參考意義，它可以縮短下一個(gè)發(fā)酵周期的延遲期從而縮短發(fā)酵周期，提高經(jīng)濟(jì)效益。