陳瑤瑤，嚴(yán)良文，劉智成，余 杰

(1.龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建龍巖 364000；2.龍巖市新羅區(qū)農(nóng)業(yè)局，福建龍巖 364000)

黃秋葵(AbelmoschusesculentusL.)俗稱洋辣椒、補(bǔ)腎草和羊角豆等[1]，隨著人們對(duì)其營(yíng)養(yǎng)保健與醫(yī)療價(jià)值的認(rèn)可，黃秋葵的栽培區(qū)域及面積也在逐年增加，是近年來(lái)南方地區(qū)早春蔬菜栽培的優(yōu)勢(shì)品種之一。黃秋葵起源于熱帶和亞熱帶，耐熱怕寒，對(duì)低溫的反應(yīng)很敏感[2]，早春容易遭受低溫冷害，植株生長(zhǎng)受到抑制，嚴(yán)重影響后期果莢的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，如何提高黃秋葵的抗寒性是生產(chǎn)上急需解決的一個(gè)問(wèn)題。

植物低溫耐受能力首先決定于植物本身的遺傳特性，不同蔬菜品種抵御低溫能力不同[3-4]。但已有研究表明，在生產(chǎn)栽培上可以通過(guò)人為干預(yù)[5-6]，如低溫鍛煉、施加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑加外源脫落酸(ABA)[7]、外源亞精胺[8]、水楊酸[9]、外源褪黑素[10]、甜菜堿[11]及采用生物技術(shù)等手段來(lái)增強(qiáng)蔬菜抵御低溫的能力[12-14]，而利用外源物質(zhì)增強(qiáng)植物抗逆性是一種經(jīng)濟(jì)有效的措施，目前已成為蔬菜作物逆境生理研究的熱點(diǎn)。

NO能夠調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，所以有人把它作為一種新的植物信號(hào)分子[15]，已有大量的研究表明NO與環(huán)境脅迫下植物抗逆性方面具有獨(dú)特的生理功能，但是，目前在蔬菜作物中這些研究主要集中在黃瓜[16-17]、南瓜[18]、番茄[19]等一些蔬菜上，且在處理濃度上還存在比較多的爭(zhēng)議。外源NO在黃秋葵上的相關(guān)研究資料較少，尤其是外源NO對(duì)黃秋葵不同品種(系)幼苗的抗低溫逆境作用機(jī)理的相關(guān)研究尚鮮報(bào)道。低溫對(duì)植株的影響主要是通過(guò)生理生化及形態(tài)的變化來(lái)體現(xiàn)，因此，本研究以3個(gè)不同品種的黃秋葵幼苗為試材，通過(guò)葉片噴施外源NO，初步探討不同濃度外源NO處理對(duì)低溫脅迫下黃秋葵幼苗生理指標(biāo)的影響，以探究外源NO對(duì)黃秋葵幼苗耐寒性的調(diào)控機(jī)理，并確定最佳的處理濃度，以期為早春黃秋葵抗低溫栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在龍巖市農(nóng)科所內(nèi)進(jìn)行。供試黃秋葵品種(系)為‘巖黃秋葵’，其種子由龍巖市農(nóng)科所果蔬室黃秋葵課題組提供，標(biāo)為Y，‘紅秋葵’種子購(gòu)于北京綠東方農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所，標(biāo)為H，‘綠霸’種子購(gòu)于日本瀧井種苗株式會(huì)社，標(biāo)為L(zhǎng)。3個(gè)品種(系)田間綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)異，抗耐性強(qiáng)，產(chǎn)量高，深受當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的喜愛(ài)，具有一定代表性。試驗(yàn)所用外源NO供體硝普鈉[Na2Fe(CN)5NO·2H2O](sodium nitroprusside，SNP)購(gòu)自福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司，純度大于99.0%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)作為處理試劑。挑選籽粒大小均勻一致的種子，經(jīng)浸種催芽后播種于穴盤中。待幼苗第3片真葉完全展開(kāi)時(shí)，挑選生長(zhǎng)一致、健壯的植株進(jìn)行處理，常溫清水標(biāo)為對(duì)照CK1，低溫(10 ℃/5 ℃)清水標(biāo)為對(duì)照CK2，在葉面噴施濃度為 0.50、1.0、1.5和2.0 mmol/L SNP的基礎(chǔ)上低溫(10 ℃/5 ℃)處理，標(biāo)為T1、T2、T3和T4，共6個(gè)處理。

用噴壺將配好的液體均勻噴施于黃秋葵的葉片上，噴到葉片滴水為止，連續(xù)噴施3 d后置于晝/夜溫度為10 ℃/5 ℃，光期12 h，暗期12 h，光照度2 000 lx，低溫處理，處理72 h后取幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)下第2片葉測(cè)定相關(guān)指標(biāo)(處理72 h為龍巖農(nóng)科所果蔬課題組前期試驗(yàn)篩選所得[20])。每處理30株，3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 株高、莖粗、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的測(cè)定 每個(gè)處理隨機(jī)選取5株，用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，測(cè)定株高、莖粗和鮮質(zhì)量，然后再放入105 ℃下殺青20 min，后75 ℃烘干至恒量，稱取干質(zhì)量。

1.3.2 抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定參考NBT光還原法[21]；過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定參考愈創(chuàng)木酚比色法[22]；過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定參照紫外吸收法[21]；抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性的測(cè)定參考陳建勛等[23]的測(cè)定方法；丙二醛(MDA)含量的測(cè)定參考硫代巴比妥酸(TBA)[21]法。以上指標(biāo)均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，均以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用WPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制；運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可知，與CK1相比，低溫逆境下3個(gè)黃秋葵品種幼苗的株高、莖粗、干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均顯著降低。Y、L和H株高分別比CK1組降低 5.25%、4.55%和2.25%，莖粗分別降低 11.11%、23.22%和15.22%，鮮質(zhì)量分別降低 9.40%、10.90%和32.35%，干質(zhì)量分別降低 3.07%、21.95%和20.59%差異顯著。說(shuō)明低溫脅迫顯著抑制黃秋葵幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。施加一定濃度外源NO處理能有效緩解低溫逆境對(duì)黃秋葵幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，增加生長(zhǎng)量，然而不同濃度SNP處理對(duì)黃秋葵生長(zhǎng)量積累的影響也有所不同。其中品種Y和H以1.0 mmol/L SNP處理效果最佳，株高、莖粗、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量較CK2處理顯著提高4.31%和1.29%、9.93%和 10.56%、11.07%和9.70%、40.63%和25.93%；品種L則在0.5 mmol/L SNP處理時(shí)的株高、莖粗、鮮質(zhì)量及干質(zhì)量達(dá)到最大值，較CK2處理提高 2.78%、8.29%、10.45%和21.74%，差異顯著。

表1 低溫脅迫下不同濃度SNP處理黃秋葵幼苗生長(zhǎng)狀況

由此可知，低溫脅迫影響黃秋葵幼苗的生長(zhǎng)，不同濃度SNP處理對(duì)低溫脅迫下幼苗的生長(zhǎng)效果不同，低濃度促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，高濃度反而抑制幼苗的生長(zhǎng)，本試驗(yàn)以0.5～1.0mmol/L處理效果較佳，但仍未能恢復(fù)到CK1水平。品種間比較，3個(gè)品種的抗寒性由高到低依次為‘巖黃秋葵’>‘紅秋葵’>‘綠霸’。

2.2 外源NO對(duì)低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗SOD活性的影響

由圖1可知，單獨(dú)低溫脅迫后黃秋葵葉片SOD活性明顯升高，3個(gè)品種CK2的活性顯著高于CK1，分別比各自對(duì)應(yīng)的CK1提高20.33%、8.61%和10.91%，不同濃度外源NO(SNP)處理后葉片SOD活性變化呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，規(guī)律性強(qiáng)。其中T2處理的含量最高，Y、L和H分別比各自CK2增加57.92%、22.47%和 32.85%，差異顯著?？梢?jiàn)，低溫脅迫會(huì)使幼苗葉片的SOD活性增強(qiáng)，適宜濃度外源SNP處理能進(jìn)一步提高低溫脅迫下SOD的活性，其中品種Y活性增加幅度最大。

2.3 外源NO對(duì)低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗POD活性的影響

由圖2可知，低溫脅迫下3個(gè)品種CK2處理的POD活性顯著高于CK1，Y、L和H分別比各自對(duì)應(yīng)的CK1提高6.96倍、5.79倍和 6.40倍。3個(gè)品種的POD活性隨著SNP處理濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，T2與各自CK2處理對(duì)比增幅最大，Y、L和H分別較CK2增加 53.05%、23.99%和31.89%，均達(dá)到顯著水平。說(shuō)明低溫脅迫增強(qiáng)幼苗葉片的POD活性，外源NO進(jìn)一步提高黃秋葵葉片POD的活性，其中對(duì)品種Y活性增加更明顯。

2.4 外源NO對(duì)低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗CAT活性的影響

由圖3可知，單獨(dú)低溫脅迫環(huán)境下，3個(gè)品種葉片CAT活性較CK1出現(xiàn)明顯的抑制現(xiàn)象，且不同品種CAT活性下降程度不同，其中L品種下降最多，達(dá)96.75%，H品種次之，下降 67.59%，Y品種下降最少為64.14%。施加低濃度SNP處理，品種Y和H的CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中以T2處理最優(yōu)，分別比CK2提高97.14%、62.08%和76.80%。當(dāng)外源NO濃度達(dá)到2.0 mmol/L時(shí)葉片CAT活性顯著低于CK1。結(jié)果表明低溫下外施NO提高品種Y和H的CAT活性，但品種L無(wú)顯著差異。

2.5 外源NO對(duì)低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗APX活性的影響

由圖4可知，與CK1相比，低溫脅迫下3個(gè)品種的APX活性均升高，但不同品種增加的幅度不同，Y和H分別增加14.88倍和2.06倍，差異顯著，L增加16.13%，無(wú)顯著差異，外源NO均不同程度上增強(qiáng)葉片APX活性，其中以T2處理的APX活性最高，Y、L和H分別比CK2增加1.64倍、1.09倍和1.20倍，均達(dá)到顯著水平。由此可知，低溫逆境會(huì)使黃秋葵幼苗葉片的APX活性增強(qiáng)，適當(dāng)濃度SNP處理能進(jìn)一步提高APX 的活性，其中增強(qiáng)效果為品種Y>H>L。

2.6 外源NO對(duì)低溫脅迫下不同品種黃秋葵幼苗MDA含量的影響

從圖5可以看出，低溫脅迫下MDA含量劇增。與CK1相比，CK2處理MDA含量明顯提高，不同品種升高的幅度不同，其中L提高的幅度最多達(dá)106.35倍，H次之為27.73倍，Y提高幅度最低為21.86倍。由于MDA作為膜脂過(guò)氧化的最重要產(chǎn)物之一，其含量的高低可以判斷逆境下植物細(xì)胞膜的損害程度，本研究表明脅迫下3個(gè)品種葉片細(xì)胞膜遭受傷害程度為L(zhǎng)>H>Y。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度SNP處理(1.5～2.0 mmol/L)導(dǎo)致MDA含量劇增，且都顯著高于CK2。低濃度外源NO處理效果好，其中T2處理效果最佳，Y、L和H的MDA含量分別較對(duì)應(yīng)的CK2降低65.30%、33.01%和42.96%，差異顯著。說(shuō)明低溫逆境引起黃秋葵葉片細(xì)胞內(nèi)MDA含量的增加，適當(dāng)濃度的SNP處理可抑制MDA的積累，在一定程度上緩解低溫逆境對(duì)細(xì)胞膜的損害，3個(gè)品種中Y品種降低最明顯。

3 討論與結(jié)論

低溫冷害是自然界中最常見(jiàn)的非生物脅迫之一，植物遭受低溫冷害，會(huì)使各項(xiàng)生理活動(dòng)減緩或停止[24]。逆境下，植物形態(tài)學(xué)特征變化反映了植物生物量的變化。本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下黃秋葵幼苗生長(zhǎng)受到抑制，生物量積累下降，施加一定濃度(0.5～1.0 mmol/L)的外源NO顯著緩解了脅迫傷害，并且3個(gè)品種的最大株高、莖粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量均超過(guò)各自對(duì)應(yīng)的CK2，表明適量的SNP處理能夠有效增強(qiáng)植株的抗低溫能力，促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，更有利于黃秋葵壯苗培育。這與張永吉等[25]和樊懷福等[26]研宄表明，SNP處理顯著提高冷害脅迫下茄子幼苗的干質(zhì)量和緩解低溫對(duì)黃瓜幼苗的抑制作用的結(jié)果相似。

抗氧化酶系統(tǒng)中APX、POD、CAT與SOD一起協(xié)同作用組成抗氧化防線共同保護(hù)植物使其免受過(guò)氧化作用造成的損傷。葉片是植物進(jìn)行光合和蒸騰作用的主要器官，能靈敏地反映外界的變化。本研究表明低溫冷害顯著抑制黃秋葵葉片CAT活性，SOD、POD和APX活性在植物遭受低溫冷害后升高，這可能是在植物到脅迫傷害后迅速激活，減輕脅迫所造成的活性氧損傷。外源NO供體硝普鈉(SNP)在提高植物葉片抗氧化酶活性，進(jìn)而提高葉片對(duì)逆境脅迫的耐受力的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，這與Liang等[27]研究表明外源NO可有效誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)從而提高耐寒性研究結(jié)果相似。

本研究表明施加外源NO對(duì)黃秋葵葉片保護(hù)酶活性表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，其中SOD、POD、CAT和APX活性在低濃度0.5～1.0 mmol/L明顯提高，高濃度又呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腟NP可通過(guò)增強(qiáng)葉片抗氧化系統(tǒng)中酶的活性以清除過(guò)量的活性氧(ROS)，從而緩解氧化傷害，增強(qiáng)黃秋葵對(duì)低溫脅迫的抗性。在較高濃度(1.5～2.0 mmol/L)處理下，SOD、POD、CAT和APX活性顯著降低，這可能是因?yàn)橹参镌诘蜏孛{迫環(huán)境下產(chǎn)生的大量活性氧離子，在未被及時(shí)清除之前，當(dāng)有大量的NO存在時(shí)，活性氧離子就會(huì)和高濃度SNP釋放的NO生成某種物質(zhì)，其破壞性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于活性氧本身的破壞程度，因此，低溫脅迫下如果加入過(guò)量外源NO不但不會(huì)緩解脅迫對(duì)黃秋葵造成的氧化傷害，還會(huì)增強(qiáng)促進(jìn)活性氧對(duì)黃秋葵的傷害。這與李美蘭等[28]在南方紅豆杉幼苗上研究認(rèn)為低濃度促進(jìn)抗氧化酶活性，高濃度反而抑制的結(jié)論相似，但是與李美蘭等[28]認(rèn)為噴施濃度為0.5和1.0 mmol/L SNP降低了抗氧化酶活性的結(jié)果不一致。這可能是由于植物品種、處理方法和脅迫時(shí)間等因素的不同而造成的差異。

低溫脅迫條件下，膜脂過(guò)氧化物的終產(chǎn)物MDA是衡量蔬菜作物耐低溫的一個(gè)重要指標(biāo)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下3個(gè)品種MDA含量顯著增加，其中品種L >H >Y，一定濃度SNP處理能有效抑制低溫脅迫下黃秋葵幼苗MDA的產(chǎn)生，緩解低溫脅迫對(duì)幼苗的膜脂過(guò)氧化損傷程度。這與已有的研究結(jié)果相一致[30-32]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫處理引起 3個(gè)黃秋葵品種SOD、POD和 APX活性均不同程度增加，但不同品種增加幅度不同。這說(shuō)明抗冷性不同的作物中存在一定的差別。通過(guò)分析外源NO對(duì)3個(gè)品種的抗低溫效果，發(fā)現(xiàn)‘巖黃秋葵’耐寒效果更明顯。因此，建議早春閩西地區(qū)黃秋葵栽培，選用‘巖黃秋葵’等耐低溫能力較強(qiáng)的品種；在低溫寒潮來(lái)臨前，可以對(duì)葉片進(jìn)行噴施一定濃度的外源NO來(lái)減緩低溫對(duì)苗期的傷害，保障黃秋葵的生長(zhǎng)。

綜上所述，在低溫脅迫下，噴施適宜濃度外源NO供體SNP可以通過(guò)調(diào)整自身生長(zhǎng)、MDA含量及抗氧化酶活性等來(lái)提高黃秋葵幼苗對(duì)低溫的適應(yīng)能力。但是NO作為一種信號(hào)分子參與了植物體內(nèi)起許多重要的生理過(guò)程[33-35]，其緩解黃秋葵幼苗低溫脅迫的作用機(jī)理尚需要進(jìn)一步的 研究。