李一丹,郭 睿,馬 征,鄭 燕,昝林森,2,李安寧

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省林業(yè)科學(xué)院，西安 710082)

羚牛(Budorcastaxicolor)別名扭角羚，屬于偶蹄目、?？芠1]，是國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，并被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(The World Conservation Union,IUCN)列為易危物種[2]。秦嶺羚牛(Budorcastaxicolorbedfordi)，又叫金毛羚牛，是4個(gè)羚牛亞種中體型最大、毛色最靚麗的。據(jù)統(tǒng)計(jì)，秦嶺羚牛的種群數(shù)量已不足6 000頭[3]，究其原因：一方面是由于其生境被破壞，棲息地面積減少；另一方面則是由于非法盜獵行為的發(fā)生。

雖然目前中國加大了對(duì)非法盜獵的打擊力度，但在金錢利益的誘惑下，羚牛非法盜獵行為仍時(shí)有發(fā)生[4]。目前，羚牛鑒定方法主要采用肉眼觀察法和形態(tài)鑒定法，但對(duì)于已切割成塊或食用的情形，僅靠肉眼或形態(tài)觀察的方法顯然不適用。但現(xiàn)存鑒定技術(shù)的操作步驟較為繁瑣，因此實(shí)際應(yīng)用過程中存在很多不便，且無法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[5-6]。另一種有關(guān)基因條形碼法來鑒定肉品真?zhèn)魏头N屬來源的研究也有報(bào)道，基于DNA 條形碼技術(shù)，可以成功對(duì)三文魚的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，并對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行溯源[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，馮慧等[8]通過建立羚牛、林麝、斑羚等15種獸類線粒體細(xì)胞色素b基因(Cytochrome b,Cytb)的基因條形碼，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)待測樣品進(jìn)行分析，從而確定其與已知15種獸類的親緣關(guān)系，但該方法同樣存在鑒定準(zhǔn)確性不高的問題[8]。因此，有必要開發(fā)一種能夠用于快速準(zhǔn)確鑒定羚牛組織的分子生物學(xué)方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)，具有高靈敏性、高特異性、高精確性的特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于肉類摻假的鑒定[9-12]。本研究擬采用qPCR技術(shù)，篩選特異性引物，為快速準(zhǔn)確地鑒定羚牛組織提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

秦嶺羚牛肌肉組織樣本采集于陜西珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心；秦川牛的肌肉組織采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心；雞肌肉組織采集于成年黃羽雞；綿羊、山羊、豬的肌肉組織分別由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院楊雨鑫副教授、王平副教授、安小鵬副教授和李曉副教授饋贈(zèng)。

1.2 基因組DNA的提取

將肌肉組織用組織破碎儀處理為細(xì)胞懸液，離心后去除上清，依次加入緩沖液GA，Proteinase K，緩沖液GB，無水乙醇，緩沖液GD，漂洗液PW，洗脫緩沖液TE。詳細(xì)步驟參見試劑盒說明書(DP304，TIANamp Genomic DNA Kit)。DNA濃度用多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200PRO,TECAN)進(jìn)行測定。

1.3 RNA的提取與cDNA反轉(zhuǎn)錄

肌肉組織采用研磨法研碎后，采用Trizol法提取總RNA(TaKaRa)，將組織樣品稱量后倒入盛有液氮的研缽中，研磨組織至粉末狀，加入RNAios plus，充分勻漿，勻漿液靜置5 min后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，勻漿裂解液中添加氯仿(RNAios plus的1/5體積量)，混合至溶液乳化成乳白色，溶液靜置5 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的離心管中，加入異丙醇(0.5～1倍RNAios plus的體積)后靜置10 min，再次4 ℃，12 000 r/min離心15 min，試管底部會(huì)出現(xiàn)RNA沉淀。RNA濃度由多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200PRO,TECAN)進(jìn)行測定，選取OD260/OD280為1.8～2.2的RNA，按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)說明書對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄[13-14]。

1.4 qPCR

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖及顯著性檢驗(yàn)分析，采用t檢驗(yàn)，以羚牛為對(duì)照?！?*”表示P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與鑒定

根據(jù)前期羚牛肌肉轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果(SRA數(shù)據(jù)庫提交號(hào):PRJNA720167)[17]，篩選出5條與牛、羊、豬和雞等物種保守性較低的轉(zhuǎn)錄本序列為模板，設(shè)計(jì)5對(duì)引物(表2)。以羚牛肌肉cDNA為模板，通過qPCR檢測5對(duì)引物的熔解峰，結(jié)果顯示引物tk-p1(TM=80.0 ℃)，tk-p3(TM=84.5 ℃)和tk-p5(TM=80.5 ℃)只有單一的熔解峰，而tk-p2(TM=77.5 ℃/84.5 ℃)和tk-p4(TM=79.5 ℃/89.0 ℃)的熔解峰為雙峰(圖1)，這表明引物tk-p1、tk-p3和tk-p5特異性較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 參考序列信息

2.2 mRNA水平驗(yàn)證引物的特異性

分別以tk-p1、tk-p3和tk-p5為引物，以秦川牛、綿羊、山羊、豬、雞和羚牛的肌肉cDNA為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示引物tk-p1的表達(dá)量在山羊中最高，羚牛中次之，這表明引物tk-p1無法用于鑒定羚牛與山羊的肌肉組織；而引物tk-p3和tk-p5的表達(dá)量在羚牛中最高，且顯著高于其在其他幾個(gè)物種中的表達(dá)(圖2)，這表明引物tk-p3和tk-p5可用于在mRNA水平區(qū)分羚牛與山羊等物種的肌肉組織。

由于肌肉組織RNA在常溫下很容易發(fā)生降解，實(shí)際鑒定過程中從mRNA水平進(jìn)行鑒定存在一定的技術(shù)局限性。如果能用基因組DNA為模板進(jìn)行鑒定，將極大地提高其實(shí)用性。

2.3 基因組DNA水平驗(yàn)證引物的有效性

為了驗(yàn)證以基因組DNA為模板進(jìn)行qPCR鑒定的可行性，分別利用tk-p3和tk-p5引物，以秦川牛、綿羊、山羊、豬、雞和羚牛的基因組DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示引物tk-p3和tk-p5在羚牛中的表達(dá)量顯著高于山羊、綿羊、秦川牛、豬和雞(圖3)。這與其在mRNA水平的表達(dá)趨勢一致，表明引物tk-p3和tk-p5可在基因組DNA水平區(qū)分羚牛與山羊等物種。

3 討 論

由于羚牛多數(shù)時(shí)間性情較為溫順，對(duì)其他動(dòng)物不會(huì)主動(dòng)發(fā)起攻擊[18]，因此容易被不法分子誘捕偷獵。在采用肉眼觀察法和形態(tài)鑒定法對(duì)非法盜獵取證時(shí)，如果羚牛個(gè)體形態(tài)保存較為完整，則鑒定相對(duì)較為容易；但如果羚牛個(gè)體已被分割或食用時(shí)，則鑒定就非常困難[5-6]。此時(shí)，就需要引入分子生物學(xué)的鑒定方法，目前主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)法、基因條形碼法、qPCR法等。

采用基于Cytb基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物測序的方法，能夠成功地鑒定出市場上摻假的肉制品[19]，但其準(zhǔn)確性并不高?；赗FLP法，可以快速準(zhǔn)確地鑒定出鹿茸的真?zhèn)蝃20]，也可用于區(qū)分牛肉、羊肉和豬肉的真?zhèn)蝃21]，還可以用于鱈魚成分的鑒定[22]，但該方法存在一定的局限性，與羚牛親緣關(guān)系較近的綿羊和山羊等未包含在Cytb基因條形碼數(shù)據(jù)庫中，因此其鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性也有待驗(yàn)證。

近年來，越來越多的研究采用qPCR法對(duì)種屬來源進(jìn)行鑒別。設(shè)計(jì)特異性qPCR引物，能成功將3種鱈科鱈魚進(jìn)行真?zhèn)舞b定，也可快速鑒定出牛、羊肉真假并且可以對(duì)其中的牛、羊肉成分含量進(jìn)行量化分析[10-11]，以豬的雌激素受體基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，基于qPCR法快速準(zhǔn)確定量檢測豬肉制品中的豬肉含量[23]。但由于羚牛與牛、羊的親緣關(guān)系很近，采用Cytb基因或雌激素受體基因無法將其準(zhǔn)確區(qū)分開。因此，選擇在秦嶺羚牛與牛、羊等物種中本研究考慮保守性較差的基因序列為模板，設(shè)計(jì)qPCR引物，對(duì)羚牛肌肉組織進(jìn)行鑒定。

截至目前，尚無羚牛參考基因組的報(bào)道。本研究根據(jù)前期羚牛肌肉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)篩選到5條與牛、羊等物種保守性較低的轉(zhuǎn)錄本，然后以這5條轉(zhuǎn)錄本為模板，設(shè)計(jì)并篩選出特異性的定量引物。采用qPCR法從mRNA水平篩選出能將羚牛肌肉組織與牛、羊等肌肉組織進(jìn)行快速有效區(qū)分的兩對(duì)定量引物。但在實(shí)際鑒定過程中，羚牛肌肉組織可能在室溫放置較長時(shí)間，RNA會(huì)發(fā)生降解。因此，進(jìn)一步采用羚?；蚪MDNA為模板，進(jìn)行qPCR分析發(fā)現(xiàn)這兩對(duì)定量引物同樣適用。這一方面豐富了利用qPCR法對(duì)種屬進(jìn)行鑒定時(shí)模板基因的選擇方法，另一方面也為羚牛組織真?zhèn)蔚蔫b定提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

本研究篩選出兩對(duì)有效qPCR引物tk-p3和tk-p5，可用于羚牛組織的真?zhèn)舞b定，為羚牛防盜獵提供了一種快速準(zhǔn)確鑒定的分子生物學(xué)方法。

致謝：感謝陜西省林科院雷穎虎副院長和陜西珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心賈康勝主任在羚牛采樣過程中給予的幫助。感謝西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院楊雨鑫副教授、李曉副教授、王平副教授、安小鵬副教授無私提供試驗(yàn)樣品。