張 晶，劉立娜，楊寶明，王永芬,3，何 平，徐勝濤，尹可鎖，李 舒，白亭亭，李永平，李迅東，鄭泗軍,4

（1云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點實驗室/云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；2江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南保山 678000；4國際生物多樣性中心，昆明 650205）

0 引言

香蕉是一種重要的熱帶和亞熱帶水果及糧食作物[1]，是世界上產(chǎn)量和消費量最大的水果之一[2-3]。根據(jù)2020年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)數(shù)據(jù)，印度是全球最大的香蕉生產(chǎn)國，其次是中國，年產(chǎn)量分別達(dá)到3046萬、1200萬t[4]。香蕉皮約占果實質(zhì)量的40%[5]，香蕉皮廢料通常會被隨意傾倒在河流、湖泊或低洼的垃圾填埋場中[6]，緩慢降解直到腐爛并形成甲烷和二氧化碳以及其他有毒氣體，如硫化氫和氨，影響附近的生態(tài)系統(tǒng)[7]，造成嚴(yán)重的環(huán)境破壞。因此，香蕉皮廢料需要回收或再利用，而不是丟棄或焚燒[6]。

作為農(nóng)業(yè)廢棄物的香蕉皮是吸附劑的理想材料，并且它對各類污染物有較好的吸附作用[8-9]。而最近香蕉皮被越來越多地報道為酚酸的重要來源[10]，尤其是青香蕉皮，酚酸被認(rèn)為是強大的天然抗氧化劑，具有抗誘變、抗病毒、抗血栓、食品添加劑和信號分子的生物學(xué)和藥理學(xué)特性[11]。對于香蕉皮酚酸的研究已經(jīng)開展很多[12-13]，有研究表示沒食子酸、奎尼酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、阿魏酸和蘆丁是其主要的酚酸[14-15]，它們與香蕉皮的抗氧化性質(zhì)緊密相關(guān)。然而，對于不同品種青香蕉皮中主要酚酸天然含量的測定研究較少。因此，迫切需要開發(fā)一種分析方法來測定來自不同香蕉品種青果皮中酚酸的含量。

許多分析方法已用于測定水果中的酚酸含量，包括毛細(xì)管電泳(CE)[16]、薄層色譜(TLC)[17]、高效液相色譜(HPLC)[18]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[19]。但是，使用 CE[20]、TLC[21]和 HPLC[22]等方法存在耗時長、靈敏度低的問題，GC-MS只能分析600 D以下的小分子酚酸。而UPLC-MS/MS具有比上述分析方法更高的靈敏度、選擇性以及更短的分析時間，并且能同時測定多種酚酸[23-24]。因此，本研究提出使用UPLC-MS/MS法測定不同品種青香蕉果皮中的酚酸含量，以期為不同生態(tài)型香蕉品種青果皮中酚酸的合理利用以及香蕉副產(chǎn)物的充分利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 供試的10份香蕉種質(zhì)資源是從國際生物多樣性研究中心引進(jìn)，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所農(nóng)業(yè)生物多樣性與香蕉研究團(tuán)隊經(jīng)過組織培養(yǎng)快速繁殖，然后種植在云南實驗基地。這10份香蕉種質(zhì)資源分別為來自馬來西亞的‘Pahang’，來自非洲的‘Inkira’和‘Kazirakwe’，以及國內(nèi)通過選育和栽培的品種‘巴西蕉’、‘熱科2號’、‘熱科4號’、‘南天黃’、‘寶島蕉’、‘中蕉8號’和‘云蕉1號’。

1.1.2 試劑 蘆丁購自上海安譜化學(xué)試劑有限公司（含量≥99.5%，批號280018），綠原酸、兒茶素和原兒茶酸購自美國Sigma公司（含量≥99.9%，批號00500590、43412、46933），奎尼酸、阿魏酸和沒食子酸均購自中國藥品生物制品檢定所（含量≥99.9%，批號WJ-110885、WTS-13455、WTS-7029）。甲醇、乙腈為色譜級（美國Fisher公司），實驗室用水由Millipore純水儀制備。

1.1.3 儀器 AB SCIEX超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，液相配有二元高壓泵、自動脫氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱及MultiQuantTM定量軟件；三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀AB SCIEX Exion AD Q-Trap 6500+System（美國AB SCIEX公司），配備電噴霧離子源(ESI)；PURELAB Option Q5超純水制備儀（英國ELGA公司）；KH-500B型超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；AllegraX-22高速冷凍離心機（美國Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜和質(zhì)譜條件 Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)。流動相A相為甲醇、B相為0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫(0%～2%A 1 min，2%～15%A 1.5 min，15%～55%A 1.5 min，55%～70%A 1.5 min，70%～90%A 1 min，90%～2%A 1 min，2%A 1.5 min)。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫35℃。

質(zhì)譜采用電噴霧離子(ESI)源，檢測模式為負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測，去溶劑溫度為500℃，離子化電壓為-5500 V，氣簾氣0.26 MPa，噴撞氣壓0.07 MPa。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制 稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解為200 mg/L的單標(biāo)溶液。使用時用超純水進(jìn)行稀釋，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品的前處理 參照香蕉成熟度色卡采收7成熟的青香蕉，用小刀將果皮與果肉分離開，稱取100.0 g新鮮香蕉果皮，清洗切片后，然后將其放入50℃烘箱中干燥7～8 h，稱重，粉碎機粉碎，經(jīng)60目篩篩分制成粉末使用。

使用單因素考察和正交4因素3水平L9(34)對香蕉果皮酚酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。精密稱取香蕉果皮粉末1.0 g，置于50 mL離心管中，加入30%的乙腈50 mL，渦旋振蕩10 s，然后70℃超聲提取40 min，5000 r/min離心10 min，取15 mL上清液于新的離心管中，以上操作重復(fù)3次，最終得到45 mL的上清液，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

所有試驗數(shù)據(jù)均為平行3次或6次后取平均值，采用IBM SPSS Statistics 22軟件和Origin 2017版進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P≤0.05將被認(rèn)為所檢驗的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料服從正態(tài)分布者采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用One-wayANOVA分析

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

為了獲得目標(biāo)分析物的最佳分離效果，采用不同濃度的流動相（0.05%、0.1%、0.2%甲酸水溶液），考察了不同混合溶劑（如甲醇-水和乙腈-水）在不同流動相比例和柱溫下分離的可行性，以優(yōu)化C18色譜柱的分離條件。結(jié)果表明，乙腈和甲醇均能洗脫這7種化合物，乙腈的洗脫能力高于甲醇，7種化合物在乙腈中很難分離，因此選擇甲醇作為有機相以更好地分離這些化合物。在水相中加入酸，使分離時分辨性準(zhǔn)確和峰形良好，但在負(fù)離子模式下，高濃度的甲酸會抑制這些化合物的豐度，降低靈敏度。溫度對色譜峰的形狀和面積影響不明顯。因此，經(jīng)過試驗，甲醇-0.2%甲酸水溶液是分離這7種化合物的適宜流動相。7種目標(biāo)物在最優(yōu)條件下的譜圖見圖1。

圖1 香蕉青果皮中7種酚酸化合物的MRM色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分析方法的發(fā)展過程始于質(zhì)量參數(shù)的優(yōu)化。在質(zhì)譜系統(tǒng)中，首次在全掃描模式(m/z100～300)下用Q1四極桿質(zhì)譜探索離子模式和母離子，用以發(fā)展MRM方法。將濃度為200 ng/mL的待測目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作液通過蠕動泵，以3 μL/min流速直接注入質(zhì)譜進(jìn)行全掃描分析，分別在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行電噴霧離子掃描(ESI)。7種化合物均在負(fù)離子模式下響應(yīng)更高，進(jìn)行負(fù)離子模式監(jiān)測，且豐度最高的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-作為母離子，通過子離子掃描模式，找到目標(biāo)物的碎片離子，并以2個豐度較高的離子作為子離子，并對碰撞能(collision energy，CE)和去簇電壓(declustering potential，DP)進(jìn)行優(yōu)化。所有優(yōu)化的MRM參數(shù)詳見表1。

表1 香蕉青果皮中7種化合物的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限 將質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的7個混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在最優(yōu)條件下進(jìn)行測定，以目標(biāo)化合物的相對峰面積為縱坐標(biāo)、與其對應(yīng)的各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7種化合物的相關(guān)系數(shù)r2為0.9992～0.9999，各目標(biāo)化合物在各自的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)來確定分析方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。香蕉青果皮7種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍以及檢出限和定量限的結(jié)果參數(shù)如表2所示。

表2 香蕉青果皮7種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.3.2 方法的回收率和精密度 精密稱取香蕉果皮樣品6份，每份1.0 g，以低、中、高3個濃度向樣品中添加各標(biāo)準(zhǔn)品[25]，混合后，按照1.2.3中的試驗方法制備供試品溶液，按上述分析方法進(jìn)行測定，每個濃度水平需平行測定6份，記錄這7個目標(biāo)成分的峰面積，對加標(biāo)回收率和精密度進(jìn)行考察。結(jié)果表明，7個化合物在線性范圍內(nèi)的平均加標(biāo)回收率為84.37%～92.17%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.21%～10.96%（表3），證明該分析方法具有良好的準(zhǔn)確性。其日內(nèi)精密度在3.75%以下，日間精密度在10.10%以下，滿足定量分析要求（表4）。

表3 7種酚酸化合物在香蕉青果皮中的加標(biāo)回收率

表4 7種酚酸化合物在10個香蕉品種青果皮中的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性

2.3.3 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗 精密稱取香蕉果皮粉末7份，按照1.2.3的試驗方法制備供試品溶液，室溫下存放，分別于0、2、4、8、12、24、36 h取樣，按1.2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果（表4）表明，7個目標(biāo)化合物的色譜峰相對峰面積的RSD均小于7.15%，供試品溶液在給定的條件下穩(wěn)定性良好。

精密稱取同一批次香蕉果皮粉末樣品6份，按1.2.3項下方法制備供試品溶液，按1.2.1項下色譜條件分析，記錄峰面積。結(jié)果（表4）表明，7個目標(biāo)化合物的色譜峰相對峰面積的RSD均小于4.10%，方法的重復(fù)性良好。

2.4 實際樣品測定

香蕉青果皮樣品經(jīng)過前處理，在優(yōu)化的試驗條件下，測定7種主要酚酸的含量。表5結(jié)果表明，這7種酚酸在不同香蕉品種青果皮間含量差異顯著。在10個香蕉生態(tài)型品種的青果皮提取物中，奎尼酸在7種主要酚酸中占據(jù)主導(dǎo)地位，綠原酸和蘆丁次之，原兒茶酸和沒食子酸含量最低（表5～6）?！甈ahang’青果皮中奎尼酸的含量最高，為172.25 mg/(100 g干重)?！甈ahang’和‘Kazirakwe’的綠原酸含量最高，顯著高于其他品種(P＜0.001)。‘Pahang’青果皮中蘆丁的含量是其他品種的4～200倍?！甈ahang’中所含兒茶素、阿魏酸和原兒茶酸的含量顯著高于其他9個品種，‘Pahang’和‘熱科4號’的沒食子酸含量最高，顯著高于其他8個品種(P＜0.001)。將這10個香蕉生態(tài)型品種按照可食用情況分為鮮食蕉和非鮮食蕉，‘Pahang’、‘Inkira’和‘Kazirakwe’屬于非鮮食蕉，其他7個品種屬于鮮食蕉。非鮮食蕉青果皮中綠原酸、蘆丁和總酚酸的含量顯著高于鮮食蕉(P＜0.001)。

表5 不同香蕉品種青果皮主要酚酸含量 μg/g

表6 鮮食蕉與非鮮食蕉青果皮總酚酸含量的比較

3 結(jié)論

本研究建立了一種同時測定不同生態(tài)型香蕉品種青果皮7種主要酚酸類化合物的UPLC-MS/MS分析方法，在9 min內(nèi)這7種酚酸化合物被有效分離，分析物的檢測限和定量限分別為0.5～1.0、1.0～3.0 μg/L，回收率為84.37%～92.17%，重復(fù)性為1.15%～4.10%。本試驗提出的方法綜合超高效液相色譜高效分離和質(zhì)譜高質(zhì)量準(zhǔn)確度的特點，實現(xiàn)了香蕉青果皮中7種主要酚酸化合物的同時測定，該方法分析時間短、簡單快速、靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確性高，可為有效提取、快速測定香蕉青果皮中主要酚酸化合物并實現(xiàn)其高效利用提供技術(shù)支持。結(jié)果表明，7種酚酸在不同香蕉品種青果皮間含量差異顯著。在10個香蕉生態(tài)型品種的青果皮提取物中，奎尼酸在7種主要酚酸中占據(jù)主導(dǎo)地位，綠原酸和蘆丁次之，原兒茶酸和沒食子酸含量最低。非鮮食蕉青果皮中綠原酸、蘆丁和總酚酸的含量顯著高于鮮食蕉(P＜0.001)，尤其以非鮮食蕉中的‘Pahang’青果皮酚酸含量最高，達(dá)到2.12 mg/g。

4 討論

酚酸類化合物是高等植物體內(nèi)普遍存在的次生代謝產(chǎn)物。在酚酸類化合物的分離中，由于酚羥基和羧基在水溶液中易發(fā)生電離，極性增強，在固定相表面會形成雙重保留，色譜峰拖尾嚴(yán)重，若加入酸性調(diào)節(jié)劑可使酚酸的電離受到抑制，有利于增強在固定相上的保留。試驗中筆者通過對不同配比的流動相系統(tǒng)乙腈-水、甲醇-水進(jìn)行分離效果的考察，流動相的pH通過不同的酸來調(diào)節(jié)，最終發(fā)現(xiàn)甲醇-甲酸水溶液的分離效果較好，進(jìn)而優(yōu)選確定甲醇-0.2%甲酸水溶液作為流動相。由于等度洗脫分析時間較長，且極性相近的成分較多，對成分測定有很大的干擾，故使用梯度洗脫，按照優(yōu)化好的色譜條件，7種酚酸在9 min內(nèi)被有效分離。這與周亞萍等[26]在20 min內(nèi)將玉米幼苗葉片中的4種酚酸類化合物有效分離，楊春霞[27]在46 min內(nèi)將枸杞中的9種酚酸化合物完全分離相比，本試驗優(yōu)化的色譜條件大大縮短了酚酸的分離時間。

測定結(jié)果證實了香蕉青果皮中酚酸化合物的組成和含量隨品種的不同而存在顯著差異[28-29]，這與Passo Tsamo等[30]的研究相似。此外，蘆丁在所有芭蕉品種和鮮食蕉‘Gros Michel’青果皮中占據(jù)主導(dǎo)地位，但它在‘hybrids(F568)’品種果皮中含量很低，甚至在鮮食蕉‘Grand Nain’品種果皮中沒有發(fā)現(xiàn)蘆丁。同樣，Suleria等[10]報道綠原酸在所測香蕉品種的青果皮中含量最高，但在所測品種果皮中均沒有發(fā)現(xiàn)原兒茶酸。

本研究結(jié)果顯示，非鮮食蕉的青果皮酚酸含量顯著高于鮮食蕉，尤其以非鮮食蕉中的‘Pahang’青果皮酚酸含量最高，并且非鮮食蕉的果皮占整個香蕉鮮重的比例很高[30]，因此非鮮食蕉的7成熟青果皮是獲取酚酸的優(yōu)質(zhì)來源。Borges等[31]也指出在非鮮食蕉的7成熟青果皮中酚酸含量高于鮮食蕉，并且發(fā)現(xiàn)鮮食蕉‘Ney Poovan’和非鮮食蕉‘Tiparot’在第5階段黃綠色香蕉果皮中酚酸含量最高，所以香蕉果皮酚酸化合物的組成和含量不僅受品種的影響，成熟度也是對其含量影響比較大的因素[32]。所以下一步將選取不同成熟度的香蕉果皮進(jìn)行試驗，探索成熟度對香蕉果皮酚酸含量的影響。

本試驗為選擇酚酸含量高的青香蕉果皮材料，將其作為膳食補充劑、食品添加劑和藥物制劑等在食品和制藥工業(yè)中進(jìn)行更好地利用提供了方法和數(shù)據(jù)方面的支持。從香蕉果皮中提取酚酸可以開發(fā)香蕉果皮的利用價值，并且香蕉皮殘渣可用作堆肥作為磷鉀來源，從而實現(xiàn)香蕉副產(chǎn)物的充分利用。下一步仍需增加香蕉品種尤其是非鮮食蕉的品種，同時對不同成熟度的果皮和果肉進(jìn)行酚酸類化合物含量的測定，以此更加全面地了解不同成熟度、不同品種香蕉中果皮和果肉酚酸化合物含量的差異，為今后高效利用香蕉果皮和果肉提供方法和科學(xué)參考。