郭藝飛， 張繼明,2

1 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 感染科， 上海市傳染病與生物安全應(yīng)急響應(yīng)重點實驗室， 國家傳染病學(xué)中心，上海 200040； 2 上海市重大傳染病和生物安全研究院， 上海 200032

慢性乙型肝炎(CHB)功能性治愈被定義為表面抗原(HBsAg)陰轉(zhuǎn)伴或不伴表面抗體(抗-HBs)的出現(xiàn)，為CHB治療的理想終點[1]。已有研究[2-3]顯示HBsAg陰轉(zhuǎn)與肝硬化甚至肝癌風(fēng)險的降低密切相關(guān)。但是自發(fā)HBsAg的陰轉(zhuǎn)發(fā)生概率極低，每年的HBsAg陰轉(zhuǎn)率約為1%[4]。即使目前核苷(酸)類似物(NUC)與聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)可以提高功能性治愈率，但由于兩類治療方法存在各自的局限性，因此了解影響CHB功能性治愈的影響因素及其機制對CHB治療具有一定的指導(dǎo)意義。

1 影響功能性治愈的因素

1.1 HBV相關(guān)因素 HBsAg為實現(xiàn)功能性治愈的關(guān)鍵標(biāo)志物?；€或停藥時低HBsAg水平、治療早期HBsAg水平的快速下降與較高的HBsAg陰轉(zhuǎn)率密切相關(guān)[5-7]。除此之外，Pfefferkorn等[8]通過對83例經(jīng)NUC或PEG-IFN治療的CHB患者進行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)作為HBsAg的組成成分之一的中表面蛋白，在總的HBsAg消失前(12.8±8.7)個月已檢測不到，提示中表面蛋白定量檢測可以預(yù)測HBsAg陰轉(zhuǎn)。

HBeAg在HBV感染的慢性化中起著重要作用[9]，而且HBsAg陰轉(zhuǎn)一般發(fā)生在HBeAg清除之后，提示HBeAg有可能影響HBsAg陰轉(zhuǎn)[10]。一項關(guān)于富馬酸替諾福韋酯治療的研究[11]表明，在A或D基因型的人群中，HBeAg在治療24周下降 ≥2.2 log PEIU/mL與更高的HBsAg陰轉(zhuǎn)率相關(guān)。

血清中高抗-HBc水平可能與肝臟內(nèi)炎癥活動增強有關(guān)[12]。近期一項研究[13]發(fā)現(xiàn)，在接受干擾素治療的CHB患者中，基線高抗-HBc水平(HBeAg陽性患者≥4.4 log IU/mL，HBeAg陰性患者≥4.0 log IU/mL)與更好的療效和更高的HBsAg陰轉(zhuǎn)率相關(guān)。

HBcrAg由乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、HBeAg和p22cr三部分組成，可以反映肝內(nèi)cccDNA水平與轉(zhuǎn)錄活性[14]。Sonneveld等[6]近期的停藥研究發(fā)現(xiàn)HBsAg水平(<100 IU/mL)、低于檢測下限的HBcrAg水平與更高的HBsAg陰轉(zhuǎn)率相關(guān)。

關(guān)于自發(fā)陰轉(zhuǎn)的一項大樣本長期隨訪研究[15]表明，不論是基線還是隨訪過程中的HBV DNA水平均與HBsAg陰轉(zhuǎn)有關(guān)。但是，在接受NUC和PEG-IFN治療的患者中，HBV DNA與HBsAg陰轉(zhuǎn)的相關(guān)性還需進一步研究。

HBV基因的分布在不同地區(qū)差異很大，歐洲主要以A、D基因型為主，東亞和東南亞地區(qū)主要以B、C基因型為主[16]。HBV感染的自然史研究及近期的停藥研究[6,17]表明在亞洲人種中，C基因型患者發(fā)生HBsAg陰轉(zhuǎn)的概率較B基因型患者高。在長期進行富馬酸替諾福韋治療的HBeAg陰性患者中HBsAg陰轉(zhuǎn)多見于A和D基因型[18]。一項接受干擾素ɑ治療的HBeAg陽性患者的長期隨訪研究[19]顯示，47%的A基因型患者和44%的B基因型患者在隨訪78周過程中發(fā)生HBsAg陰轉(zhuǎn)，只有28%的C基因型患者和25%的D基因型患者發(fā)生HBsAg清除。

1.2 宿主相關(guān)因素 研究[20]表明自發(fā)HBsAg清除與年齡有關(guān)，HBsAg陰轉(zhuǎn)率隨著年齡的增大逐漸升高。關(guān)于CHB兒童治療的研究發(fā)現(xiàn)，越早治療其HBsAg陰轉(zhuǎn)率越高。一項關(guān)于1～17歲HBeAg陽性患兒長達13年的隨訪研究[21]顯示，11.08%的患兒在PEG-IFN治療72周后實現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)，在隨訪結(jié)束時，46.95%的患兒實現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)，其中1～7歲的患兒HBsAg的陰轉(zhuǎn)率可達71.4%。近期關(guān)于學(xué)齡前兒童的研究[22]同樣表明對于自發(fā)出現(xiàn)ALT水平升高且接受抗病毒治療的患兒陰轉(zhuǎn)率可達25%。

ALT水平升高被視為機體免疫介導(dǎo)清除病毒的表現(xiàn)，被證實與干擾素治療實現(xiàn)的HBsAg陰轉(zhuǎn)密切相關(guān)[5]。對于免疫控制期的患者，PEG-IFN治療早期HBsAg水平的快速下降及12周時ALT的升高是預(yù)測HBsAg陰轉(zhuǎn)的獨立因素。

1.3 治療方案 大量臨床研究[23-24]證明NUC與PEG-IFN的聯(lián)合治療是實現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)最有效的方式。值得注意的是，相較于NUC與PEG-IFN的初始聯(lián)合治療，接受過長期NUC治療并獲得病毒學(xué)應(yīng)答的患者加用或換用PEG-IFN治療時HBsAg水平下降幅度更大且HBsAg陰轉(zhuǎn)率更高[25]。

2 影響功能性治愈的相關(guān)機制

2.1 HBV相關(guān)因素影響功能性治愈的機制

目前關(guān)于HBV慢性感染的機制尚未完全闡明。觀察性研究顯示單獨使用NUC并不能提高CHB的功能性治愈率，而以免疫調(diào)節(jié)為主要作用的干擾素卻可顯著提高HBsAg陰轉(zhuǎn)率，提示功能性治愈的實現(xiàn)需要適度激活機體的抗病毒免疫。

2.1.1 HBV相關(guān)因素與特異性免疫 在HBV急性感染時，CD8+T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)在HBV清除上發(fā)揮主要作用，但是在HBV慢性感染時，HBV特異性T淋巴細胞功能被抑制甚至出現(xiàn)耗竭[26-27]，還有研究[28]表明在HBsAg陰轉(zhuǎn)的人群中呈現(xiàn)出與未陰轉(zhuǎn)人群不同的CD4+T、CD8+T淋巴細胞表型，科學(xué)家推測恢復(fù)HBV特異性T淋巴細胞的功能可能是實現(xiàn)乙型肝炎功能性治愈的途徑之一。Kim等[29]通過比較低HBsAg水平(<500 IU/mL)和高HBsAg水平(>50 000 IU/mL)患者中HBV特異性T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)HBV特異性CD4+T淋巴細胞上程序性死亡受體1(PD-1)在低HBsAg水平的患者中表達較低，使用PD-1阻斷劑后可以提高T淋巴細胞的抗病毒免疫。但是也有研究[30-31]顯示，HBsAg水平并不影響HBV特異性T淋巴細胞反應(yīng)，患者年齡是影響HBV特異性CD4+、CD8+T淋巴細胞功能的關(guān)鍵因素。Aliabadi等[30]研究者發(fā)現(xiàn)低HBcrAg水平也與HBV特異性CD4+T淋巴細胞反應(yīng)有關(guān)。此外，有研究[27]表明HBeAg狀態(tài)也會影響HBV特異性T淋巴細胞，HBeAg陽性患者中針對核心抗原的干擾素γ和IL-10反應(yīng)都受到抑制。近期一項研究[32]比較了急性HBV感染、慢性HBV感染以及功能性治愈人群中HBV特異性CD4+T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)在急性HBV感染的人群中呈現(xiàn)出強烈的HBV特異性記憶CD4+T淋巴細胞反應(yīng)；慢性HBV感染者中，HBV特異性CD4+T淋巴細胞頻率低且HBV特異性CD4+中央型記憶T淋巴細胞極少；功能性治愈者中，HBV特異性CD4+T淋巴細胞和CD4+中央型記憶T淋巴細胞的頻率較慢性感染者明顯增加，該研究提示HBV特異性CD4+T淋巴細胞反應(yīng)在功能性治愈中發(fā)揮著重要作用。

B淋巴細胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答在HBV清除中也起到重要作用，當(dāng)應(yīng)用B淋巴細胞清除療法(如利妥昔單抗)時，HBV再激活風(fēng)險顯著增加[33]。在CHB患者中，HBsAg特異性B淋巴細胞在外周血中頻率低，非典型性記憶B淋巴細胞(CD21-CD27-)的數(shù)量增加且分泌抗體能力較差[34-35]，使用PD-1阻斷劑可部分恢復(fù)HBsAg特異性B淋巴細胞的功能[36]。相較于HBsAg特異性B淋巴細胞，HBcAg特異性B淋巴細胞頻率高且分泌抗體能力較強，一項近期研究[13]發(fā)現(xiàn)基線抗-HBc水平與干擾素療效密切相關(guān)，但造成HBsAg特異性B淋巴細胞與HBcAg特異性B淋巴細胞功能不同的機制尚未闡明。B淋巴細胞的主要作用是針對HBV抗原產(chǎn)生多克隆抗體從而發(fā)揮中和作用清除病毒，抗-HBs的出現(xiàn)被視為是CHB功能性治愈的標(biāo)志之一，近期的一項研究[37]納入感染HBV A基因型并接受NUC治療HBeAg陽性的CHB患者，發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)的患者中抗-HBs和HBsAg組成的免疫復(fù)合物的峰值與ALT峰值相重合，但是在未實現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)的人群中，兩者的高峰并不重疊，提示抗-HBs在實現(xiàn)功能性治愈中扮演著重要作用。

2.1.2 HBV相關(guān)因素與固有免疫 HBV感染可逃避機體的固有免疫[38]。在一項探究HBV垂直感染更易慢性化的研究[9]中，發(fā)現(xiàn)親代體內(nèi)HBeAg可上調(diào)子代小鼠肝臟中巨噬細胞上細胞程序性死亡配體1(PD-L1)的表達，從而抑制HBV特異性T淋巴細胞，提示HBeAg在CHB的持續(xù)性感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本課題組通過比較CHB四個自然史時期的患者中髓系來源的抑制性細胞(MDSC)的頻率，發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性的CHB患者中MDSC頻率明顯高于HBeAg陰性患者，體外實驗闡明了HBeAg可以誘導(dǎo)MDSC擴增，進而通過上調(diào)吲哚胺2,3-雙加氧酶的表達抑制T淋巴細胞功能[39]。Visvanathan等[40]還發(fā)現(xiàn)HBeAg可下調(diào)肝細胞、Kupffer細胞和外周單個核細胞上Toll樣受體(TLR)2的表達從而抑制TLR介導(dǎo)的抗病毒免疫。HBeAg除了可調(diào)節(jié)機體的免疫，Mitra等[41]研究人員發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)形式的HBeAg顯著降低干擾素刺激反應(yīng)元件的活性以及干擾素刺激基因(ISG)的表達，同時在干擾素治療的患者中，HBeAg陽性的患者較HBeAg陰性的患者誘導(dǎo)ISG表達的能力弱。

樹突狀細胞(DC)在抗原呈遞及活化T淋巴細胞過程中起到重要作用，當(dāng)DC經(jīng)HBsAg處理后，呈現(xiàn)出免疫耐受的表型，分泌IL-12即激活T淋巴細胞抗病毒的能力也大大減弱[42]，由此推測低HBsAg水平可以恢復(fù)DC的部分功能，活化T淋巴細胞的能力增強進而更易發(fā)生HBsAg陰轉(zhuǎn)。NK細胞發(fā)揮抗病毒效應(yīng)主要通過釋放殺傷靶細胞的細胞因子(如干擾素γ、干擾素α等)和發(fā)揮抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(antibody-dependent cell-medicated cytotoxicity，ADCC)[43]。在PEG-IFN治療中，不論是肝臟內(nèi)還是外周血中NK細胞功能增強組較未增強組其ALT水平更高且HBsAg水平下降更為明顯[44]。此外，有研究[37]提示ADCC可能在CHB功能性治愈中也發(fā)揮一定的作用。

2.2 宿主相關(guān)因素影響功能性治愈的機制 在機體免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全之前，HBV感染時年齡越小越傾向于形成HBV持續(xù)性感染，但臨床研究[21]表明開始CHB治療越早，功能性治愈率越高，其內(nèi)在機制并未闡明。近期Fang等[45]研究者發(fā)現(xiàn)HBsAg可上調(diào)MDSC上的趨化因子受體CCR9，MDSC遷移至胸腺髓質(zhì)區(qū)清除尚未發(fā)育成熟的HBsAg特異性T淋巴細胞，提示早期治療有可能會逆轉(zhuǎn)HBV的免疫耐受狀態(tài)從而實現(xiàn)功能性治愈。除此以外，有研究[30-31]表明HBsAg水平并不影響HBV特異性T淋巴細胞反應(yīng)，患者年齡是影響HBV特異性CD4+、CD8+T淋巴細胞功能的關(guān)鍵因素，當(dāng)年齡<30歲時，HBsAg特異性T淋巴細胞占總HBV特異性T淋巴細胞群的28.26%，但當(dāng)年齡>30歲時，此比例降至7.14%。

ALT升高主要是由免疫介導(dǎo)，可被視為體內(nèi)清除病毒的表現(xiàn)，但由于影響ALT因素較多，探索ALT升高的相關(guān)機制對于確定CHB治療方案非常必要。有研究[46]顯示，在CHB患者中，HBV特異性CD4+T淋巴細胞以分泌TNFα為主，且該細胞頻率與ALT水平相關(guān)，但這群細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)會加重肝損傷，而在實現(xiàn)功能性治愈的患者中，HBV特異性CD4+T淋巴細胞以分泌干擾素γ為主。該研究還發(fā)現(xiàn)在ALT升高期間，HBsAg下降水平與表面抗原特異性分泌干擾素γ的CD4+T淋巴細胞頻率呈正相關(guān)。

2.3 治療方案影響功能性治愈的機制 根據(jù)NUC與PEG-IFN聯(lián)合治療取得的良好成效提示參與抗病毒與免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)機制在實現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要作用。PEG-IFN通過誘導(dǎo)ISG產(chǎn)生眾多抗病毒蛋白,作用于病毒復(fù)制周期的各個階段從而發(fā)揮直接抗病毒的作用，同時，體外實驗[47]證實干擾素可促進胞內(nèi)cccDNA降解。NUC直接靶向病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，有效抑制HBV的復(fù)制，此作用可增強PEG-IFN所激發(fā)的固有免疫與特異性免疫細胞功能，有助于HBsAg的清除[48]。

3 小結(jié)

目前針對HBV生命周期的抗病毒藥物以及免疫調(diào)節(jié)類藥物的研發(fā)為實現(xiàn)更高比例的功能性治愈帶來了希望。但是關(guān)于CHB功能性治愈的機制仍未完全闡明，更為深刻的理解HBV免疫耐受形成機制以及如何消除免疫耐受將為之后實現(xiàn)CHB完全治愈提供可能。