高子翔， 沈忠良,2， 劉 晶,3， 謝幼華,4

1 復旦大學教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院醫(yī)學分子病毒學重點實驗室， 上海醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學系，上海 200032； 2 復旦大學附屬華山醫(yī)院 感染科， 上海市傳染病與生物安全應急響應重點實驗室，國家傳染病醫(yī)學中心， 上海 200040； 3 復旦大學 生物醫(yī)學研究院， 上海 200032；4 上海市重大傳染病和生物安全研究院， 上海 200032

HBV感染可引起急、慢性乙型肝炎(CHB)，肝纖維化，肝硬化和肝癌等肝臟疾病。HBV是一種基因組約為3.2 kb的部分雙鏈環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)的包膜病毒。成熟的HBV顆粒也稱為Dane顆粒：內(nèi)含由核心抗原(HBcAg)組裝成的二十面體核心顆粒，核心顆粒內(nèi)主要為rcDNA以及與其共價偶聯(lián)的病毒聚合酶；宿主來源的脂質(zhì)包膜上嵌有不同比例的乙型肝炎大、中、小表面抗原(large/middle/small hepatitis B s antigen, L/M/S HBsAg)。目前對HBV感染肝細胞的過程已有初步的認識。首先HBV特異性識別肝細胞膜上的鈉離子-牛黃膽酸鈉共轉運蛋白受體并通過內(nèi)吞的方式進入肝細胞；隨后核心顆粒攜帶rcDNA進入細胞核，并通過特殊的修復機制形成共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)；最后cccDNA作為轉錄的模板啟動HBV的基因表達和復制。細胞核內(nèi)cccDNA能夠與組蛋白和非組蛋白等因子組裝為微小染色體，其穩(wěn)定存在于細胞核內(nèi)是CHB患者難以治愈的關鍵原因。

機體免疫反應同HBV的清除或持續(xù)性感染密切聯(lián)系。大量研究表明，急性感染中某些細胞因子的分泌水平與HBV特異的殺傷性T淋巴細胞活化相關；而在慢性感染中，某些抑制性細胞因子參與HBV特異性免疫細胞的耗竭，進而無法有效清除病毒。因此通過對各類細胞因子功能研究將有助于為抗病毒治療提供新的候選靶點。

1 白細胞介素(IL)

IL包括多個家族，主要由免疫細胞所產(chǎn)生，是一類能夠調(diào)控細胞免疫與體液免疫的細胞因子。

1.1 IL-1家族 IL-1是一種炎癥細胞因子, 包括IL-1α和IL-1β。在一項研究[1]中發(fā)現(xiàn)，CHB患者血清中IL-1水平遠高于非HBV感染者，而用HBV體外刺激非HBV感染者的外周血單核細胞能明顯提高IL-1的分泌，表明HBV慢性感染可能促進IL-1表達/分泌；但當HBV病毒載量達到一定水平時，反而降低血清中IL-1的水平，表明HBV對IL-1的表達/分泌的調(diào)控具有雙重性。有關IL-1抗HBV感染的研究主要集中于IL-1β。在體外實驗中，乙型肝炎e抗原(HBeAg)通過抑制IL-1β激活的NF-κB信號通路，增強HBV復制；在對干擾素α(IFNα)治療無應答的CHB患者中，IL-1β的分泌水平被顯著抑制[2-3]；在體外感染模型中，IL-1β能夠顯著抑制不同基因型的HBV RNA水平[4]。上述研究表明HBV可能通過抑制IL-1β的抗病毒效應來維持病毒的持續(xù)感染，而IL-1β可能作為一種潛在的抗HBV治療候選分子。

IL-18是參與輔助性T淋巴細胞(Th)1和2型免疫平衡調(diào)節(jié)的多功能細胞因子。IL-18最初是在研究IFNγ的誘生過程中被發(fā)現(xiàn)的，與IL-1具有相似的生物學特性。研究[5]表明在小鼠模型上，IL-18能夠與IL-12協(xié)同誘導IFNγ產(chǎn)生，進而抑制HBV；另一方面，HBeAg可拮抗IL-18介導的信號通路抑制IFNγ分泌，可能有助于維持HBV持續(xù)感染；研究[6]發(fā)現(xiàn)低水平的IL-18不能有效誘導IFNγ的產(chǎn)生，從而導致孕鼠體內(nèi)Th1/Th2細胞免疫失衡，造成宮內(nèi)HBV持續(xù)感染，這些證據(jù)表明，IL-18的高表達有利于病毒的清除。但是過高表達的IL-18可以加重肝損傷，具有潛在的治療風險[7]。因此，闡明IL-18與抗HBV感染、肝損傷三者間的相互關系，明確IL-18的有效作用濃度、給藥頻次等，將有助于推動IL-18在抗HBV感染中的臨床轉化。

IL-33作為警報信號蛋白而廣泛存在于多種組織和細胞中，并在應激條件下可分泌出胞，參與機體的炎癥反應。有研究[8]表明，IL-33能夠通過激活濾泡輔助性T淋巴細胞進而提高抗HBV的體液免疫水平；另一方面，病毒性肝炎中IL-33與其膜上受體ST2表達水平的升高常與肝纖維化發(fā)展進程相關。本課題組前期研究[9]發(fā)現(xiàn)，基于尾靜脈高壓水動力注射的HBV急性小鼠模型血清中 IL-33的表達水平顯著高于慢性小鼠。為進一步研究IL-33是否具有抗病毒治療潛能，將IL-33的過表達質(zhì)粒注射到CHB小鼠，發(fā)現(xiàn)IL-33可以清除血清及肝內(nèi)HBV抗原和DNA，同時也檢測到肝內(nèi)大量免疫細胞的聚集。這些研究結果表明IL-33可促進HBV特異性Th1和Th2免疫反應水平，同時也可能與肝臟疾病進程相關。此外，近期也有體外研究[10]發(fā)現(xiàn)IL-33能夠直接抑制HBV基因的表達，但是具體機制仍待進一步探究。

IL-36包括促炎因子IL-36α、IL-36β、IL-36γ和天然受體拮抗劑IL-36Ra。這些促炎因子共用同一受體IL-36R，并在多種疾病的炎癥和纖維化進程中發(fā)揮作用。Gong等[11]發(fā)現(xiàn)CHB患者血清中的IL-36α水平與HBV病毒載量呈正相關性。由于該研究樣本量較少，因此IL-36與HBV的關系仍待驗證和闡明。

IL-37是一種由多類細胞產(chǎn)生并分泌的抗炎癥因子，IL-1家族的新成員。研究[12]表明CHB患者經(jīng)替比夫定治療后，其HBeAg血清學轉化中伴隨IL-37水平的降低，推測IL-37可能參與抗HBV免疫反應。但其是否在抗HBV中發(fā)揮作用仍需要更多研究來明確。

1.2 IL-2家族 IL-2是一種促進炎癥反應的T淋巴細胞生長因子，在調(diào)節(jié)免疫反應過程中發(fā)揮重要作用，能夠增強T淋巴細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)的殺傷活性，也能維持調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)的功能等。早在20世紀，IL-2就被批準應用于癌癥治療，但是其嚴重的副作用令患者飽受困擾。研究[13]發(fā)現(xiàn)，在CHB感染中，特異性CD4+T淋巴細胞的耗竭是導致IL-2分泌減少的重要原因，可能是HBV免疫耐受機制中的重要一環(huán)。因此，研究人員對IFNα治療無應答的CHB患者給予低劑量的IL-2序貫治療，發(fā)現(xiàn)該方案能夠顯著活化HBV特異性T淋巴細胞并提高HBeAg血清學轉化率[14]。此外，曾報道有研究者[15]嘗試對1例HBV相關肝硬化患者使用低劑量的IL-2進行免疫治療，并取得一定的療效。這些結果表明，雖然IL-2在臨床治療應用中可能有一定的風險，但通過優(yōu)化治療方案(如優(yōu)化IL-2的注射劑量、頻次、患者入選標準)，可能為CHB患者提供一種新的治療選擇。

IL-4主要由Th2分泌，通過促進Th2分化且抑制Th1反應，參與體液免疫與細胞免疫調(diào)節(jié)。研究[16]表明CHB患者血清中IL-4的水平顯著低于非感染人群，但在接受抗病毒治療后，血清中IL-4水平顯著升高并伴隨HBV DNA載量降低。此外，在肝癌細胞系中，IL-4可顯著抑制HBV的基因表達和復制[17]。但也有一些證據(jù)[18]顯示，IL-4可能有利于HBV的持續(xù)感染。因此，IL-4在HBV持續(xù)感染中可能具有雙重作用，仍然需要進一步的研究，闡明具體機制。

IL-15是一種調(diào)控NK細胞、NKT細胞以及CD8+T淋巴細胞功能和穩(wěn)態(tài)的細胞因子，具有抗腫瘤和抗病毒的作用。IL-15能夠顯著增加特異性CD8+T淋巴細胞，同時IL-15水平也與NK細胞功能恢復存在一定的正相關性；在小鼠模型中，肝內(nèi)過表達的IL-15能夠以IFNβ依賴的方式抑制HBV復制[19]；IL-15也可與IFNα協(xié)同增強特異性CD8+T淋巴細胞功能，進而發(fā)揮抗病毒作用[20]。上述結果表明IL-15具有活化抗HBV的特異性和非特異性免疫反應，特別是增強抗HBV細胞免疫的活性。

IL-21主要來自于濾泡輔助性T淋巴細胞、Th17以及NKT細胞，其受體廣泛分布于多種細胞，具有調(diào)節(jié)B淋巴細胞、CD4+和CD8+T淋巴細胞活性，發(fā)揮抗腫瘤和抗病毒等多種功能。筆者前期研究[21]發(fā)現(xiàn)，急性HBV小鼠模型血清中IL-21水平顯著高于慢性HBV小鼠；將IL-21表達質(zhì)粒注射到慢性HBV小鼠后可清除體內(nèi)HBV，提示IL-21具有抗HBV治療的潛在可能性。進一步將攜帶IL-21基因的腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)基因治療載體(AAV-IL-21)注射到數(shù)種CHB小鼠模型，結果表明AAV-IL-21具有良好的治療效果，并揭示IL-21主要是通過活化殺傷性CD8+T淋巴細胞而發(fā)揮抗HBV功能。也有報道[22]顯示，IL-21通過逆轉CD8+T淋巴細胞耗竭狀態(tài)，加速HBsAg的清除而發(fā)揮抗病毒作用。這些研究均表明IL-21具有作為新的治療HBV候選分子的潛能。但是值得注意的是IL-21對HBV的清除與年齡有關[23]，同時持久性高水平IL-21可能導致HBV相關的肝損傷[24]。因此，需優(yōu)化精準個體治療方案，避免或降低治療過程中的不良后果及風險。

1.3 IL-6/12家族 IL-6是單核細胞活化后產(chǎn)生的一種多效的細胞因子，同時具備促炎和抗炎活性。研究[25]表明CHB患者血清中IL-6水平顯著高于非感染人群，并且高水平IL-6可促進肝細胞癌增殖，因此與不良預后有關。但是也有研究[26]顯示，IL-6能夠顯著抑制cccDNA轉錄活性，降低HBV復制。因此，IL-6的多效性在HBV治療中可能是一把雙刃劍，對其應用的推進仍需要開展更深入的研究工作。

IL-12是一種由樹突狀細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞等免疫細胞分泌的炎癥因子，具有促進幼稚T淋巴細胞向Th1分化、調(diào)節(jié)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和NK細胞的殺傷能力等功能。在急性HBV患者中，血清IL-12水平顯著升高；而在CHB患者中，IL-12表達水平較低，提示IL-12可能具有抗HBV功能[27-28]。在CHB小鼠模型上，采用IL-12與乙型肝炎疫苗聯(lián)合療法，發(fā)現(xiàn)IL-12能夠“打破”HBV特異性CD4+T淋巴細胞的免疫耐受，激活特異性CD8+T淋巴細胞反應，實現(xiàn)HBV清除，且在部分小鼠可實現(xiàn)HBV表面抗體(抗-HBs)血清學轉化[29]。相關研究[30]也進一步證實IL-12具有恢復HBV特異性CD8+T淋巴細胞的抗病毒功能。這些證據(jù)都顯示IL-12在CHB治療中具有潛在的應用前景。

IL-27是一種主要由活化的樹突狀細胞和巨噬細胞分泌，并在固有免疫和適應性免疫中發(fā)揮重要作用的多效型細胞因子。在HBV感染中，研究[31]發(fā)現(xiàn)IL-27可促進IFNλ1表達，進而抑制HBV的基因表達和復制；也有研究[32]表明IFN刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)三基序蛋白25(tripartite motif 25，TRIM25)能顯著抑制HBV，在此過程中IL-27也發(fā)揮關鍵作用，因此IFN-IL-27-TRIM25信號軸可能是新的抗病毒靶點。此外，在適應性免疫方面，研究[33]揭示IL-27能夠有效增強B淋巴細胞免疫反應，改善總抗體產(chǎn)生能力及提高針對HBsAg的IgG和IgM分泌量，進而顯著降低血清中HBsAg和HBV DNA水平。但IL-27在HBV感染的免疫中也可能通過發(fā)揮促炎作用造成肝損傷。所以在臨床轉化前，需深入探究IL-27的作用機制，據(jù)此優(yōu)化CHB的治療方案。

1.4 IL-10家族 IL-10作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，主要具有抑制促炎因子分泌、終止炎癥反應以及促進B淋巴細胞分化產(chǎn)生抗體的能力。目前研究認為IL-10可通過抑制過度免疫反應，起到保護機體的功能，但也能抑制病原體清除，進而造成病原體持續(xù)感染。在HBV慢性感染過程中，血清中IL-10的異常升高與HBV DNA載量和肝臟炎癥相關，這可能是引起HBV慢性化甚至促進纖維化進展的重要原因之一；值得注意的是，在淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒感染的小鼠模型中，通過拮抗阻斷IL-10受體可促進病毒清除[34]。上述研究提示通過阻斷IL-10受體，抑制IL-10的功能發(fā)揮有可能遏制HBV慢性感染。

1.5 IL-17家族 IL-17主要由Th17產(chǎn)生并分泌，具有促進炎癥反應的功能。與其他促炎因子相似，在HBV感染中，IL-17與肝損傷、肝硬化及肝細胞癌的發(fā)生密切相關。在CHB感染中，IL-17的分泌異常將加重炎癥反應，促進肝纖維化、肝硬化等[35]。由此可見，IL-17在HBV相關疾病進展中發(fā)揮了關鍵作用。體外實驗[36]表明，IL-17具有通過提高黏病毒抗性蛋白A和人寡聚腺苷酸合成酶的表達進而抑制HBV復制的能力，上述研究盡管提示IL-17具有抗HBV活性，但是考慮到其在體內(nèi)可誘導肝病進展，將其應用于抗病毒治療應謹慎。

2 集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)

CSF家族主要包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage-CSF，GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte CSF，G-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage CSF，M-CSF)。GM-CSF具有誘導樹突狀細胞成熟、分化以及促進抗原遞呈細胞的呈遞能力，因此被用作抗腫瘤或抗病毒的免疫治療佐劑。Wang等[37]發(fā)現(xiàn)HBV轉基因小鼠經(jīng)GM-CSF預處理后再接種乙型肝炎疫苗，可打破免疫耐受狀態(tài)，激活HBV特異性體液免疫(HBsAg血清學轉化)和CTL反應，促進病毒清除。需要注意的是，GM-CSF的不當使用也可能會導致免疫抑制反應。對GM-CSF抗病毒機制及安全性的深入研究有可能推動GM-CSF組合乙型肝炎疫苗的治療方式進入臨床轉化。

3 干擾素(IFN)

IFN自發(fā)現(xiàn)以來，已成為一種被廣泛應用的抗病毒治療藥物。IFN家族主要分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型IFN：Ⅰ型IFN主要包括IFNα和IFNβ，Ⅱ型IFN為IFNγ，Ⅲ型IFN包括IFNλ1、IFNλ2、IFNλ3和IFNλ4。

大量的研究已經(jīng)證實盡管存在一定副作用，IFNα在CHB患者治療中具有良好的抗病毒效果，特別是聚乙二醇(PEG)修飾進一步延長了體內(nèi)IFNα的生物學活性，使得PEG-IFNα成為臨床上主要的抗病毒藥物之一。IFNα的抗HBV作用不僅涉及眾多的免疫調(diào)控反應，也涉及到肝細胞內(nèi)的直接抗病毒過程。IFNα可通過誘導ISG的表達，從而抑制HBV的基因表達和復制。在一項體外感染實驗[38]中，研究發(fā)現(xiàn)高劑量的IFNα除了可以有效抑制HBV，還能夠引起cccDNA發(fā)生脫氨基反應，形成無嘌呤無嘧啶位點(AP位點)后被核酸內(nèi)切酶降解。因此IFN是少數(shù)能夠直接降解cccDNA的細胞因子，但該作用是在過高劑量下的體外實驗系統(tǒng)觀察到的，這意味著該研究仍處于前期研究階段。另一方面，在小鼠模型及患者中，IFNα通過發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，激活NK細胞、HBV特異性B淋巴細胞和T淋巴細胞等效應，最終實現(xiàn)HBV清除。

IFNα具有許多亞型，不同亞型展現(xiàn)出了不同程度的抗病毒和抗細胞增殖等生物學功能。Chen等[39]研究發(fā)現(xiàn)IFNα14在體外和小鼠模型內(nèi)均表現(xiàn)出最優(yōu)的抗HBV效果，該工作為優(yōu)化IFNα的抗HBV治療提供了新選項。此外，IFNα還可同臨床一線藥物核苷(酸)類似物聯(lián)用，提高抗病毒治療效果。另一方面，雖然IFNα在抗病毒治療中具有良好的效果，但是治療前需要評估潛在的風險和不良反應，并根據(jù)不同患者特征制訂個體化治療方案以期達到更好的臨床治療效果，并降低副作用。

除了Ⅰ型IFN外，Ⅱ和Ⅲ型IFN也具有類似的抗HBV功能，如Ⅱ型IFN能誘導脫氨基作用降解肝細胞內(nèi)的cccDNA，也能誘導活化HBV特異性T淋巴細胞促進HBV清除[40]；Ⅲ型IFN也可通過誘導肝細胞產(chǎn)生ISG，進而抑制HBV的基因表達和復制[41]。

4 轉化生長因子β(TGFβ)

TGFβ主要包括TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，在調(diào)控免疫系統(tǒng)和抗病毒感染中發(fā)揮雙重作用。一方面，TGFβ可以增強Treg活性介導抗炎作用；另一方面，TGFβ促進Th17分化并分泌促炎因子。許多證據(jù)表明HBV感染能夠提高TGFβ的表達，促進細胞外基質(zhì)沉積，進而破壞肝臟結構引起肝損傷。但也有研究[42]表明，TGFβ通過激活脫氨基反應誘導病毒cccDNA的降解。深入研究TGFβ的抗病毒機制或許對TGFβ應用于CHB治療具有指導意義。

5 趨化因子

趨化因子是一類小分子蛋白，能夠促進白細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞的定向運動，參與腫瘤轉移、慢性炎癥以及自身免疫性疾病等。趨化因子主要包括CXC家族、CX3C家族、CC家族和C家族，其中同HBV關系最密切的是CXC家族。Yoshio等[43]發(fā)現(xiàn)，在HBV急性感染的人和黑猩猩中， 血清中CXC配體(CXC-ligand，CXCL)9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的水平顯著升高而在CHB患者中則未觀察到，值得注意的是，患者在抗病毒治療中，隨著HBsAg血清學的轉化可觀察到CXCL13的升高，推測CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的水平與HBsAg血清學轉化有關；此外，肝臟中CXCL13的高表達有利于淋巴細胞浸潤，為CD8+T淋巴細胞的抗病毒反應提供有利的微環(huán)境[44]。除了CXC家族，最近一項研究[45]發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中，CC配體9可以活化HBV特異性CD8+T淋巴細胞加速HBV清除。綜上，趨化因子可能參與介導抗HBV的特異性免疫反應，并且部分成員可能作為CHB治療的靶點?？傮w上，目前對于趨化因子在HBV感染中作用的研究尚不充分。

6 小結

HBV持續(xù)感染仍是全球范圍內(nèi)的一個重大公共衛(wèi)生問題，每年約有60萬人死于HBV相關的肝臟疾病，因此急需研發(fā)新的抗病毒治療策略和藥物，提高臨床治愈率。鑒于在CHB過程中，HBV cccDNA長期存在于肝細胞中，且人體免疫系統(tǒng)受到病毒的壓制，因此適度提高免疫系統(tǒng)功能可能是治療HBV最有效的手段。但是，目前對于大多數(shù)細胞因子在HBV慢性感染中作用的認識仍不深入，還未充分闡明涉及的生理與病理作用機制。此外，大多數(shù)細胞因子具備多種生物學功能，如具有抗病毒功能的同時也加速肝臟疾病進展，或者細胞因子的不同水平呈現(xiàn)出截然不同的抗病毒或促進病毒復制的活性，因此不能對各種細胞因子的抗HBV作用進行簡單的定義和劃分。目前需要對于不同類型的細胞因子進行更全面的分析研究，鑒定出在體內(nèi)有潛在治療價值的細胞因子。對于準備進入臨床轉化階段的細胞因子，在臨床試驗中應結合CHB患者具體的病毒學指標和疾病進展情況，確定受試患者，制訂個性化治療方案。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：高子翔、沈忠良負責查找文獻，分析資料，撰寫文稿；謝幼華、劉晶負責確定寫作思路，指導文章撰寫及最終修改定稿。