游六勇，羅文英

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 湛江 524000）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是臨床上常見的革蘭陰性桿菌，也是醫(yī)院慢性感染的主要原因之一[1]。細(xì)菌生物膜是一種主要由細(xì)菌自生的胞外多聚物所構(gòu)筑的膜樣結(jié)構(gòu)，其作為支架將細(xì)菌包裹在生物或者非生物表面，保護(hù)細(xì)菌免受外部環(huán)境壓力、阻礙免疫細(xì)胞吞噬，賦予細(xì)菌長期定植和抗生素耐藥的能力[2，3]。近年來生物膜相關(guān)的慢性感染如囊性肺纖維化、傷口感染、牙周疾病等發(fā)病率顯著增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。有研究表明[4-6]，生物膜與某些癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，如乳腺植入物相關(guān)的淋巴瘤、頭頸部相關(guān)腫瘤、腺瘤性息肉病的早發(fā)性息肉形成等。由于生物膜的復(fù)雜性和特殊性，生物膜相關(guān)感染通常在長期臨床靜止后反復(fù)，單一的抗生素治療往往難以有效殺滅生物膜相關(guān)感染的病原菌，給臨床控制生物膜相關(guān)感染帶來了極大的挑戰(zhàn)。本文就銅綠假單胞菌生物膜干預(yù)治療研究作一綜述。

1 生物膜的一般特征

生物膜是包裹在菌體外由胞外多糖，基質(zhì)蛋白和e-DNA組成的聚集體，其形成過程通常有幾個階段，即微生物細(xì)胞對表面的初始附著、附著細(xì)胞的聚集、生物膜的生長成熟以及生物膜分散[7，8]。粘附素，Ⅳ型菌毛，Psl 和脂多糖參與銅綠假單胞菌的初始附著過程，并受c-di-GMP 和小調(diào)節(jié)RNA（sRNA）調(diào)節(jié)。生物膜成熟的特征是生物膜結(jié)構(gòu)的形成和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，此過程主要受QS 調(diào)控[9]。生物膜分散階段包括剝落、侵蝕和擴(kuò)散，其中剝落和侵蝕是被動脫離，而擴(kuò)散是主動脫離[10]。研究表明[11]，不含活菌的生物膜也有一定促進(jìn)其他微生物定植的潛力，說明殺滅細(xì)菌可能對于治療生物膜相關(guān)感染遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，消除生物膜也是抗菌治療中的關(guān)鍵問題。

2 生物膜的干預(yù)治療

2.1 抗生素 抗生素的主要作用是殺滅微生物，達(dá)到治療感染的目的。但對于銅綠假單胞菌來說，臨床常用的抗生素往往難以穿透生物膜作用于細(xì)菌菌體，導(dǎo)致臨床治療效果差，感染控制不佳，患者病情遷延不愈。但也有研究表明某些抗生素具有抑制或消除生物膜的作用，如牛瑜等[12]研究表明，亞抑菌濃度（1/16 MIC、1/4 MIC）的阿奇霉素以及克拉霉素均可顯著降低銅綠假單胞菌在醫(yī)用微孔濾膜模型上的生物膜黏附。Bala A 等[13]研究表明，阿奇霉素能影響銅綠假單胞菌的膜通透性，進(jìn)而影響相關(guān)信號分子3-oxo-C12-HSL 等的穿透，最終導(dǎo)致生物膜形成及黏附受到抑制。Gupta P 等[14]研究表明，亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星雖然不能抑制銅綠假單胞菌的生長，但是能通過抑制彈性蛋白酶及毒力因子的產(chǎn)生，從而抑制生物膜的形成。目前亞抑菌濃度抗生素對銅綠假單胞菌生物膜的影響作用研究多停留于短期體外研究，而對于長期暴露亞抑菌濃度抗生素的實(shí)驗(yàn)及相關(guān)機(jī)制研究較少，因此其相關(guān)研究方向值得討論。

2.2 抗生素的聯(lián)合使用 銅綠假單胞菌生物膜的形成是其耐藥的主要機(jī)制，生物膜作為一層物理屏障，可有效延緩或阻止大部分臨床抗菌藥物的滲入。某些抗生素能通過抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成或分解已經(jīng)成熟銅綠假單胞菌生物膜，為難以滲透銅綠假單胞菌生物膜的抗生素提供條件，也為抗生素的聯(lián)合使用提供基礎(chǔ)。對于銅綠假單胞菌來說，抗生素的聯(lián)合使用不僅能減少單一抗生素的使用劑量，還能大大提高對銅綠假單胞菌的殺滅能力。Gloria H 等[15]研究表明，與單一抗生素相比，妥布霉素與多粘菌素的聯(lián)合使用可顯著減少銅綠假單胞菌生物膜模型細(xì)菌的數(shù)量，降低大鼠肺部感染模型的細(xì)菌數(shù)量及死亡率，改善肺部感染模型的病理情況。張艷芳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類藥物聯(lián)合阿米卡星可能通過抑制致病因子藻酸鹽、蛋白水解酶和綠膿菌素的分泌，顯著降低臨床分離的銅綠假單胞菌生物膜的形成。臨床在治療銅綠假單胞菌引起的生物膜相關(guān)感染時應(yīng)綜合考慮藥效和個體化情況，合適的抗生素組合可能是未來研究的重點(diǎn)。

2.3 藥物新用途 由于研發(fā)新型抗生素周期長、花費(fèi)大，很多研究者積極開發(fā)已有藥物的新型用途，并發(fā)現(xiàn)了一些抗生物膜的潛在藥物，因此開發(fā)現(xiàn)有藥物的新型用途也成為了的熱門研究方向[17]。阿司匹林作為一種非甾體類解熱鎮(zhèn)痛消炎藥被廣泛應(yīng)用于心血管及風(fēng)濕免疫性疾病，其具有廣譜抗菌活性。王央霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)，5 mg/ml 阿司匹林劑量便可抑制銅綠假單胞菌的生長。此外，阿司匹林不僅能顯著抑制生物膜的形成，還能促使24 h 生物膜的分解，使銅綠假單胞菌的初始黏附功能降低50%左右。乙酰半胱氨酸作為黏液溶解劑，可通過斷裂痰液中糖蛋白多肽鏈，產(chǎn)生較強(qiáng)的黏痰溶解作用。趙鐵梅等[19，20]研究發(fā)現(xiàn)，乙酰半胱氨酸能減少生物膜中基質(zhì)樣物質(zhì)的形成，小劑量乙酰半胱氨酸還能增強(qiáng)左氧氟沙星對生物膜內(nèi)銅綠假單胞菌的殺菌活性，在大鼠氣道銅綠假單胞菌生物膜感染模型中，霧化吸入乙酰半胱氨酸與生理鹽水組對比，前者導(dǎo)管被覆的不定型物質(zhì)明顯變薄，小劑量乙酰半胱氨酸還能增強(qiáng)環(huán)丙沙星在大鼠氣道銅綠假單胞菌生物膜感染模型中的治療效果。臨床上常見的化痰藥巰乙磺酸鈉與氨溴索也可抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，協(xié)同增強(qiáng)常見抗生素的治療效果[21，22]。雖然藥物的新用途可能是緩解新藥開發(fā)壓力的途徑，但大部分被研究的抗生物膜活性實(shí)驗(yàn)僅在體外條件下試驗(yàn)，對其體內(nèi)的抗生物膜療效需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，臨床應(yīng)用尚待商榷。

2.4 抗菌肽及其類似物 抗菌肽是天然免疫的重要成分，其不僅具有抗菌、抗病毒等活性，某些抗菌肽還具有抗銅綠假單胞菌生物膜的活性。Lashua LP 等[23]研究表明，WLBU2 抑制生物膜與非生物表面以及與氣道上皮細(xì)胞結(jié)合，且呈劑量依賴性；不僅如此，WLBU2 還明顯增強(qiáng)了常用抗生素妥布霉素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶和美羅培南對銅綠假單胞菌的殺傷力。Taha MN 等[24]研究表明，LIVRHK 和LIVRRK 兩種新型的合成肽雖然不抑制銅綠假單胞菌的生長，但能通過降低lasI、lasR、rhlI 和rhlR的基因表達(dá)水平，影響細(xì)胞膜及相關(guān)毒力因子的產(chǎn)生，包括胞外蛋白酶、鼠李糖脂等。Nisin 是一類具有抗菌性能的短陽離子兩親性肽，Wang SY 等[25]研究表明，Nisin 能抑制胞外多糖和e-DNA的產(chǎn)生，從而抑制銅綠假單胞菌在納濾膜和PES 膜上的附著，進(jìn)一步抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成?？咕挠捎谄浞N類豐富、很少產(chǎn)生耐藥及強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，是代替抗生素的理想物質(zhì)，但是由于產(chǎn)量低、體內(nèi)穩(wěn)定性差、細(xì)胞毒性大、合成昂貴等原因，導(dǎo)致目前大規(guī)模臨床應(yīng)用仍有一定的困難。

2.5 中成藥物 中藥及中成藥物使用歷史悠久，近年來隨著對中藥成分及機(jī)制的研究，中藥在抗生物膜方面的療效也得到的越來越多的證實(shí)。Geng YF 等[26]研究表明，木犀草素能夠通過降低QS 信號分子N-（3-氧十二烷基）-l-高絲氨酸內(nèi)酯（OdDHL）和N-丁基-l-高絲氨酸內(nèi)酯（BHL）的積累，下調(diào)QS 基因（lasR、lasI、rhlR 和rhlI）的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成。Majumdar M 等[27]研究表明，穿心蓮內(nèi)酯能通過減少細(xì)胞外聚合物質(zhì)的含量，抑制細(xì)胞外蛋白酶的合成，從而達(dá)到抑制生物膜形成的作用，同時穿心蓮內(nèi)酯還可與常規(guī)抗生素如阿奇霉素等產(chǎn)生協(xié)同作用，將穿心蓮內(nèi)酯與阿奇霉素共同處理銅綠假單胞菌48 h，可使其生物膜減少92%。雖然有大量研究證實(shí)多種中藥能通過各種途徑抑制細(xì)菌生物被膜的形成，但中藥對生物膜影響的相關(guān)研究還處于表面現(xiàn)象，對其相關(guān)機(jī)制的研究或?qū)⒊蔀榻窈笱芯康闹攸c(diǎn)。

2.6 新型材料 隨著科技的發(fā)展，越來越多的新型材料與傳統(tǒng)的醫(yī)藥結(jié)合，為解決銅綠假單胞菌生物膜相關(guān)的抗生素耐藥的問題提供了全新的思路。Thorn CR 等[28]研究發(fā)現(xiàn)一種仿生納米結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)液晶納米粒子LCNPs，在人支氣管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，霧化LCNPs 聯(lián)合妥布霉素與單純霧化妥布霉素相比，銅綠假單胞菌感染部位的抗生素濃度可提高100 倍，且新型納米制劑能降低傳統(tǒng)抗生素的使用劑量，同時增大抗生素的抗生物膜活性。Snk A等[29]研究發(fā)現(xiàn)，TPGS-PLGA 納米粒顯著提高了阿奇霉素的抗菌活性和生物膜預(yù)防活性，而OSA-HA納米凝膠則降低了黏蛋白相互作用，同時還能消除已經(jīng)形成的銅綠假單胞菌生物膜，降低阿奇霉素的使用劑量，改善阿奇霉素對肝細(xì)胞及上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性。使用納米顆粒或納米凝膠，包裹運(yùn)送常規(guī)抗生素，以提高生物膜內(nèi)藥物濃度，降低細(xì)菌耐藥及抗生素的使用劑量，是抗生物膜治療非常有前景的途徑。

2.7 物理療法 隨著抗菌素耐藥菌株的增加，移植物表面生物膜相關(guān)感染也日趨增多，開發(fā)輔助性的方法治療生物膜相關(guān)感染非常很重要。Pourhajibagher M等[30]研究表明，光動力療法（PDT）可使銅綠假單胞菌abaI、agrA 和lasI的表達(dá)水平下調(diào)約3.7 倍，進(jìn)而影響生物膜的形成。劉立婷等[31]研究表明，不同強(qiáng)度的低頻超聲聯(lián)合環(huán)丙沙星干預(yù)治療銅綠假單胞菌生物膜，可不同程度地破壞其生物膜結(jié)構(gòu)，殺滅生物膜內(nèi)細(xì)菌，且輻照劑量呈依賴性。

3 總結(jié)

雖然抗生素仍是臨床中治療感染的主要武器，但是由于抗生素研發(fā)難度大、研發(fā)周期長、耐藥突變快等缺點(diǎn)及生物膜感染的治療困難，臨床迫切需要針對生物膜的特異性治療方法和新的治療方法來加強(qiáng)常規(guī)抗生素的使用。新型殺菌劑和抗生物膜菌劑和抗生物膜藥物的使用，促進(jìn)了生物膜的擴(kuò)散，破壞了生物膜的自然發(fā)育階段，為開發(fā)新的治療方法提供了很好的途徑。而日益明確的分子機(jī)制，也使靶向微生物生物膜制劑可能成為細(xì)菌根除的個性化方法。通過積極研究生物膜的復(fù)雜機(jī)制及抑制策略，制定精準(zhǔn)化的治療方案與措施，是未來治療生物膜相關(guān)感染的方向。