崔吉浩　高世慶　宗憲春

蛋白桑組織培養(yǎng)探究

崔吉浩高世慶宗憲春

（牡丹江師范學院生命科學與技術學院黑龍江牡丹江157011）

本研究以蛋白桑帶腋芽的莖段為實驗材料，進行蛋白桑再生體系的建立。結(jié)果顯示，蛋白桑莖段適宜消毒組合為75%乙醇20 s＋升汞7 min，萌發(fā)率達89.47%，但污染率24%；不定芽增殖方面，適宜培養(yǎng)基為MS＋3 mg/L 6BA，不定芽增殖系數(shù)達到4.50；在生根培養(yǎng)方面，蛋白桑適宜生根培養(yǎng)基為MS＋0.1 mg/LNAA和1/2 MS＋0.1 mg/LNAA，生根率均為96%，但從節(jié)約成本上看，更適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1mg/LNAA；在煉苗移栽方面，煉苗最佳天數(shù)為4 d，成活率達到88%。

蛋白桑；組織培養(yǎng)；植株再生

蛋白桑，別名飼料桑，也叫雅津蛋白桑，是1998年北京桑梁技術發(fā)展中心科學家從全國28個桑樹品種中優(yōu)選培育出的雜交優(yōu)勢桑，其是一種適合我國南北方栽培，高產(chǎn)、高效、高蛋白的優(yōu)質(zhì)桑科樹種[1-2]。蛋白桑具有很高的經(jīng)濟價值、生態(tài)價值以及藥用價值。蛋白桑是優(yōu)良的畜禽飼料，在反芻動物的飼草料的配制研究方面具有很高的潛在價值[3]。本研究以蛋白桑莖段作為實驗材料，探究不同濃度配比的MS培養(yǎng)基及不同植物生長調(diào)節(jié)劑對蛋白桑莖段不定芽增殖的影響，以及不同激素濃度的培養(yǎng)基中不定芽生根的差異，并分析煉苗時間對蛋白桑移栽馴化的影響，從中篩選出適宜蛋白桑莖段不定芽增殖和生根的培養(yǎng)基方案，為蛋白桑快速繁殖和種質(zhì)資源保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗原材料為蛋白桑種子，由牡丹江師范學院提供，播種生長成植株后，取帶腋芽的莖段進行組織培養(yǎng)實驗。

1.2 方法

1.2.1 外植體的培養(yǎng)

選取飽滿、無損傷的蛋白桑種子，先用50 ℃左右的溫水浸泡種子，然后自然冷卻到室溫，浸種24 h后播種到花盆中，室溫下培養(yǎng)，待長成植株后備用。

1.2.2 外植體的消毒

截取蛋白桑生長健壯的一年生枝條的中上部，用自來水沖洗1 h后將其剪成1 cm～2 cm的莖段（每個小段至少帶有一個芽點），置于超凈工作臺。先用75%的乙醇消毒20 s，然后用無菌水沖洗4次～5次，再用0.2%的升汞設置不同的時間（5 min、7 min、9 min）進行消毒，最后用無菌水沖洗4次～5次。將消毒后的莖段置于帶有濾紙已滅菌的培養(yǎng)皿中，吸收完多余水分后，接種于MS培養(yǎng)基中。每個消毒處理接種10瓶，每瓶接種5個莖段，重復3次。15 d后觀察并統(tǒng)計萌發(fā)率和污染率，公式如下：

污染率＝接種污染數(shù)/接種總數(shù)×100%

萌發(fā)率＝芽點萌發(fā)個數(shù)/（接種芽點的總個數(shù)－污染的芽點個數(shù)）×100%

1.2.3 不定芽的增殖

截取帶有腋芽的莖段，在不同植物激素濃度的MS培養(yǎng)基（見表2）中進行接種，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種3個，重復3次。30 d后觀察不同激素濃度的培養(yǎng)基中不定芽的增殖情況，統(tǒng)計并計算增殖系數(shù)，公式如下：

增殖系數(shù)＝高于0.5 cm的苗總數(shù)/接種數(shù)×100%

1.2.4 生根培養(yǎng)

選擇長至2 cm～3 cm且生長良好的不定芽，在無菌條件下進行剪切，將其接種到不同濃度植物激素配比的培養(yǎng)基（見表3）中。每種培養(yǎng)基接種50瓶，每瓶接種1個，15 d以后觀察統(tǒng)計生根情況，并計算生根率，公式如下：

生根率＝形成根的芽數(shù)/接種的芽總數(shù)×100%

1.2.5 煉苗和移栽

生根15 d后，選擇長勢良好且根系發(fā)育較好的植株，打開培養(yǎng)瓶封口膜，分別煉苗0 d、2 d、4 d和6 d。煉苗后從無菌瓶中取出植株，沖洗干凈培養(yǎng)基，移栽到盛有滅菌土的花盆中，室溫下培養(yǎng)，觀察20 d，記錄生長情況。

1.2.6 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基中均添加30 g蔗糖、6 g瓊脂，pH值調(diào)至5.8，分裝后在121 ℃的濕熱環(huán)境中滅菌20 min，室溫冷卻備用。接種后，培養(yǎng)瓶置于溫度（25±2）℃，光照強度2 000 lx～2 500 lx，光照時間14 h/d的條件下培養(yǎng)。

1.2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

實驗中測定的基礎數(shù)據(jù)用Excel軟件處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對蛋白桑莖段的影響

經(jīng)過不同的消毒時間處理，培養(yǎng)15 d后蛋白桑莖段的萌發(fā)和污染情況如表1所示。從表中數(shù)據(jù)可以看出，用75%乙醇和升汞對蛋白桑莖段進行消毒處理，不同的消毒時間影響蛋白桑不定芽的萌發(fā)。其中，75%乙醇消毒20 s＋升汞消毒7 min的萌發(fā)率最高，為89.47%，但污染率達24%。75%的乙醇消毒時間一定，隨著升汞消毒時間延長至9 min，污染率降低，僅為16%，但芽點萌發(fā)個數(shù)以及萌發(fā)率下降，萌發(fā)個數(shù)為72個，萌發(fā)率僅為57.14%，可能是升汞的處理時間過長，對幼嫩的外植體產(chǎn)生的傷害較大，對外植體的表面保護層及芽點生長處造成了破壞。

表1不同消毒時間下蛋白桑莖段的萌發(fā)和污染情況

編號溶液及處理時間接種個數(shù)污染個數(shù)污染率/%萌發(fā)個數(shù)萌發(fā)率/% 75%乙醇/s氯化汞/min M120515039269686.49 M2207150362410289.47 M320915024167257.14

2.2 蛋白桑的不定芽增殖

不同激素濃度配比的培養(yǎng)基中，不定芽增殖情況如表2所示。由表2可以看出，僅添加3 mg/L 6-BA（細胞分裂素）的培養(yǎng)基（CB6）中，不定芽增殖效果最好，增值系數(shù)達4.50。

表2不同植物激素組合中不定芽的增殖情況

編號激素種類及用量接種個數(shù)增殖個數(shù)增殖系數(shù) 6-BA/mg/LKT/mg/L CBK111901171.30 CBK21.51.5901261.40 CK302901301.45 CK403901261.40 CB520902923.25 CB630904054.50

2.3 蛋白桑的生根培養(yǎng)

不同濃度NAA和MS配比的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d后不定芽生根情況如表3所示。

表3生根培養(yǎng)基的配方及生根率

編號培養(yǎng)基組成生根率/% CS1MS＋0.1 mg/LNAA96 CS2MS＋0.2 mg/LNAA95 CS3MS＋0.3 mg/LNAA88 CS41/2 MS＋0.1 mg/LNAA96 CS51/2 MS＋0.2 mg/LNAA94 CS61/2 MS＋0.3 mg/LNAA92

一般無菌芽接種15 d后即可生根，而培養(yǎng)基中添加植物激素，對生根影響顯著。由表3可知，MS培養(yǎng)基中添加NAA濃度為0.1 mg/L、0.2 mg/L時，生根率分別為96%和95%，且根系粗壯、數(shù)量較多。1/2 MS培養(yǎng)基中添加NAA濃度為0.1 mg/L和0.2 mg/L時，生根率分別為96%和94%，根系粗壯、數(shù)量多。從節(jié)約成本的角度考慮，1/2 MS＋0.1 mg/LNAA組合的培養(yǎng)基（CS4）更適宜作為蛋白桑生根培養(yǎng)基方案。

同時觀察發(fā)現(xiàn)，生根期間根部均出現(xiàn)不同程度的褐化，可能是桑樹自身分泌物導致，但其對根的生長幾乎沒有影響。

2.4 蛋白桑的煉苗移栽

蛋白桑生根培養(yǎng)15 d后，打開培養(yǎng)瓶封口膜，煉苗4 d，然后進行移栽，蛋白桑幼苗生長茁壯，成活率最高，達88%。煉苗2 d后進行移栽，蛋白桑幼苗葉片少許發(fā)黃，生長較慢。煉苗6 d后進行移栽，幼苗葉片蜷縮，枯萎現(xiàn)象較為嚴重，死亡過半。而未進行煉苗的蛋白桑移栽至花盆后，枯萎現(xiàn)象嚴重，最終全部死亡。因此，蛋白桑適宜煉苗時間為4 d，幼苗長勢較好。

3 討論

3.1 植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的污染問題

進行植物組織培養(yǎng)時，材料帶菌、操作不規(guī)范以及其他不利的環(huán)境因素，均會導致污染情況的發(fā)生[4]。細菌污染的主要特征是實驗材料表面產(chǎn)生黏液狀物質(zhì)，或是渾濁的水跡狀物質(zhì)，應注意徹底消毒實驗用具。常見的真菌污染有曲霉屬、鐮刀霉屬以及青霉屬等的真菌，防治真菌污染時，常用的殺菌劑種類較多，如酒精、氯化汞、次氯酸、漂白粉等[4]。殺菌劑可以有效地殺死植物組織表面帶有的真菌，但其要易漂洗或自行分解，如果出現(xiàn)殘留，將會對植物組織產(chǎn)生毒害作用[5]。此外，定期對超凈工作臺等相關儀器進行消毒及規(guī)范無菌操作很有必要。

秦新慧等[6]（2016）在沙地蛋白桑高效組培快繁體系的建立中，對實驗材料進行消毒時，使用75%的乙醇消毒20 s，然后用濃度0.1%的氯化汞溶液消毒8 min，污染率為28%。本實驗使用濃度為75%的乙醇和0.2%的升汞作為消毒劑，采用不同的消毒時間，篩選出蛋白桑莖段適宜的消毒時間組合為75%乙醇20 s＋升汞7 min，污染率為24%。

3.2 植物激素對芽增殖的影響

植物激素是通過微小劑量便能夠圍繞植物的生長發(fā)育開展相應調(diào)控的生物活性物質(zhì)[7]，其作為植物體內(nèi)的特殊信息傳輸載體，即便含量不高，也能顯著影響植物體的生長和繁殖[8]。不同種類的激素組合，不同的濃度配比，對植物體的不定芽再生產(chǎn)生不同影響?，F(xiàn)在普遍使用的植物激素有6-BA、NAA、KT、ZT、2,4-D等。陳權等（2021）在不定芽增殖中使用濃度為3.0 mg/L的6-BA，增殖速度快，增殖系數(shù)為2.65[9]。劉明輝等（2003）通過研究得出，細胞分裂素6-BA可能是桑樹不定芽增殖的必需物質(zhì)[10]。本實驗中，與陳權等[9]（2021）的分析結(jié)果一致，使用3.0 mg/L的6-BA不定芽增殖效果最好；采用不同的激素組合來分析其對誘導芽增殖的影響，可以發(fā)現(xiàn)6-BA濃度是誘導芽增殖的關鍵，與劉明輝等[10]（2003）的結(jié)論一致。

4 結(jié)論

本研究通過蛋白桑再生體系的建立，得到蛋白桑莖段適宜消毒組合為75%乙醇20 s＋升汞7 min，萌發(fā)率89.47%，污染率24%；不定芽增殖方面，適宜培養(yǎng)基為MS＋3 mg/L 6BA，不定芽增殖系數(shù)達到4.50；此外，蛋白桑適宜生根培養(yǎng)基為MS＋0.1 mg/LNAA和1/2 MS＋0.1 mg/LNAA，生根率均為96%，但從節(jié)約成本的角度考慮，更適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1mg/LNAA；在煉苗移栽方面，煉苗適宜天數(shù)為4 d，成活率高達88%。

[1]BETTELHEIM K A.Role of non-O157 VTEC[J].Symp Ser Soc Appl Microbiol,2000(29):38S-50S.

[2]FURLAN J P R,GALLO I F L,DE CAMPOS A C L P,et al.Characterization of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) obtained from feces of sheep in Brazil[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2019,35:134.

[3]KARMALI M A.Factors in the emergence of serious human infections associated with highly pathogenic strains of shiga toxin-producing Escherichia coli[J].Int J Med Microbiol,2018,308(8):1067-1072.

[4]王朝雯.植物組織培養(yǎng)的污染及防治措施[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技,2020,3(8):29,35.

[5]高弘揚,許丹蕓,周良云,等.試管苗玻璃化現(xiàn)象的研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2019(20):52-56,59.

[6]秦新慧,崔興林,武興寶,等.沙地蛋白桑高效組培快繁體系的建立[J].經(jīng)濟林研究,2016,34(3):169-174.

[7]岳川,曾建明,章志芳,等.茶樹中植物激素研究進展[J].茶葉科學,2012,32(5):382-392.

[8]曾勤飛,熊洋鳳.植物學中的植物激素分析[J].花炮科技與市場,2019(4):281-282.

[9]陳權,陳慧蘭,張承妹,等.大花蔥愈傷組織誘導分化及不定芽增殖研究[J].上海農(nóng)業(yè)科技,2021(3):71-73.

[10]劉明輝,王國忠,徐家萍.桑樹冬芽組織培養(yǎng)品種效應研究[J].中國蠶業(yè),2003,24(1):19-20.

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.04.03

S888

A

2095-1205(2022)04-07-03

黑龍江省教育廳項目（20200177）

崔吉浩（1996- ），男，黑龍江牡丹江人，碩士研究生，研究方向為遺傳育種與生物技術。

宗憲春（1966- ），女，山東金鄉(xiāng)人，博士，教授，研究方向為遺傳育種與生物技術。