馮任倩，臧樂靖，楊一恒，黃嘉禾，韓夢菲，朱炬帆，胡 燕

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產科，溫州 325000)

宮頸癌已成為全球威脅女性健康的第四大惡性腫瘤，據GLOBOCAN數據庫最新統(tǒng)計，2020年全世界超60萬例婦女被診斷為宮頸癌，其中約34萬人次死亡[1]。目前高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)持續(xù)感染被認為是引起子宮頸鱗狀上皮內病變以及宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關鍵因素，但現(xiàn)階段尚無根治的特效藥物或方法。

自噬是一種真核細胞內由溶酶體介導的分解代謝過程,在多種生理、病理過程中發(fā)揮適應性作用。越來越多的研究證實，細胞自噬及自噬相關蛋白的異常表達與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關，且HPV感染可影響自噬活性。目前有關自噬在HPV持續(xù)感染過程中發(fā)揮的作用尚未明確。本文就自噬與HPV感染及病毒持續(xù)狀態(tài)發(fā)生相關性的研究進展作一綜述，旨在拓展對HPV持續(xù)感染發(fā)生機制的認識，為臨床建立新治療方案提供思路。

1 細胞自噬的概述

自噬是一種自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG)調控的細胞內降解途徑，向溶酶體輸送不必要或功能失調的成分。根據待降解成分進入溶酶體的不同方式，自噬可分為：分子伴侶介導的自噬、微自噬、巨自噬。既往研究中涉及的多為巨自噬，該過程分為3個階段：(1)雙膜囊泡(自噬體)形成并包裹受損細胞器或大分子組分等待降解物；(2)自噬體向溶酶體靠攏、融合形成自噬溶酶體；(3)內容物被分解釋放至胞漿中，以供組織細胞循環(huán)利用。目前已發(fā)現(xiàn)41種參與自噬過程的基因，其中18種屬于核心自噬相關基因[2]。在ATG蛋白中，如微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，哺乳動物中ATG8同系物之一，水解形成LC3-I并和磷脂酰乙醇胺結合轉化成LC3-Ⅱ，以膜標記物的形式表達于自噬體表面；Beclin 1是酵母ATG6/Vps30的哺乳動物同源物，也是啟動自噬的必需蛋白質。

自噬是綜合應激反應的核心元素，當饑餓、缺氧、細胞損傷等情況出現(xiàn)時，可被刺激以維持細胞內穩(wěn)態(tài)。自噬不僅負責清除異常胞內組分，還可清除包括病毒和細菌在內的入侵病原體及其他感染因素[3]。此外，自噬異常還與多種人類疾病甚至癌癥密切相關。

2 HPV感染與自噬相互作用

2.1 HPV的內吞過程可抑制自噬 HPV是一種無包膜包被的雙鏈DNA病毒，由病毒基因組和衣殼蛋白(L1、L2)組成，基因組分為早期編碼區(qū)(E1、E2、E4、E5、E6和E7)、晚期編碼區(qū)(L1、L2)和長控制區(qū)，而E5、E6、E7基因編碼病毒的E5、E6、E7癌蛋白。HPV的結合和感染可能發(fā)生在因性交引起的生殖道微創(chuàng)傷處的基底層角質形成細胞中，病毒通過L1附著于細胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)并相互作用，引起L2構象改變、蛋白水解，進而被內吞進入宿主細胞[4]。病毒與HSPGs相互作用可觸發(fā)多種HPV感染相關信號通路，內化過程可激活依賴mTOR通路的自噬抑制過程[5]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通常在磷酸肌醇3-激酶(PI3K)信號通路的下游被激活。HPV附著于宿主細胞后與質膜上的表皮生長因子受體相互作用，引起蛋白激酶B(Akt)磷酸化、磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)滅活以及活化下游的mTOR并觸發(fā)mTORC1底物，后者激活PI3K/Akt/mTOR通路，抑制細胞自噬[5]，避免病毒被早期清除，增加HPV感染幾率。

2.2 HPV癌蛋白影響不同自噬階段 E5、E6、E7癌蛋白通過影響自噬過程的不同階段來阻止病毒清除，促進細胞癌變。Belleudi等[6]研究顯示，在HPV陰性的角質形成細胞系中，異位表達HPV16的E5蛋白可下調角質形成細胞生長因子受體(KGFR/FGFR2b)的表達，后者相關信號通路誘導自噬，使胞內LC3-Ⅱ水平下降，自噬底物p62蛋白積累，自噬體數減少，提示自噬體組裝失敗。而沉默E5基因則可消除該影響。由此提示E5蛋白在感染初期可能阻止自噬體的形成[7]。在發(fā)生機制方面，Belleudi發(fā)現(xiàn)，E5可通過抑制自噬基因轉錄激活來干擾自噬(包括p53非依賴性自噬基因Beclin 1、ATG5、LC3，p53依賴性自噬基因ULK1、ULK2、ATG4a、ATG7及p53下游靶基因p21、14-3-3σ)，進而抑制自噬小體裝配。

E6、E7蛋白通過影響自噬體和溶酶體的融合過程抑制自噬。Mattoscio等[8]實驗結果顯示，在過表達E6/E7的HPV陽性原代人角質形成細胞中，脂質化的LC3和p62表達均增加，提示自噬體仍在形成，但自噬降解能力呈降低趨勢。共聚焦和電子顯微鏡分析則直觀顯示，細胞中的自噬溶酶體形成減少，明確指出自噬體和溶酶體間的融合過程是受E6/E7影響的缺陷階段。此外，Hanning等[9]使用siRNA靶向耗竭HPV16細胞的E6/E7 mRNA后發(fā)現(xiàn)自噬被誘導激活。這與上述研究相符，提示HPV癌蛋白在感染早期通過不同機制抑制自噬，本質上最終都阻止了自噬溶酶體的形成。

2.3 HPV分型與自噬 HPV按致癌潛能分為高危型HPV(HR-HPV)和低危型HPV(low risk human papillomavirus,LR-HPV)，不同亞型的HPV對自噬的影響不同[10]。自噬與HPV相互作用的研究主要集中于HR-HPV。Surviladze等[11]發(fā)現(xiàn),人角質形成細胞系暴露于HPV16偽病毒后出現(xiàn)病毒-宿主細胞相互作用，刺激PI3K/Akt/mTOR途徑并抑制自噬，這對病毒的早期感染至關重要?？旅罘糩12]研究顯示，在無感染、HPV單一感染及HPV多重感染三組中，Beclin1和LC3B表達水平逐漸下降，在HPV16、18亞型感染細胞中進一步降低，提示HPV感染抑制細胞自噬，且HPV多重感染和 HPV16/18亞型感染能進一步加重其對自噬的抑制作用。也有研究顯示，HR-HPV對自噬有激活作用。Ishii等[13]在電子顯微鏡下觀察到HPV16偽病毒感染細胞后自噬體生成增加。Griffin等[14]報道HPV16在具有較高基礎自噬水平的原代人包皮角質形成細胞中感染率最低，實驗結果提示病毒粒子顯著誘導該組細胞的自噬，從而抑制感染過程，應用自噬抑制劑治療后可顯著增強病毒感染性。

Zhang等[15]研究報道，低危型HPV11的早期蛋白E6通過抑制Akt/mTOR和 Erk/mTOR通路激活自噬，分析可能原因是HPV11的E6異位表達會增加能量需求因而引發(fā)代謝應激，自噬水平提高可維持宿主細胞的生存和病毒的增殖。雖然機制尚未完全闡明，但確定不同HPV亞型對宿主自噬影響的相似性和差異性或許非常重要。

3 HPV持續(xù)感染中的自噬調控

3.1 自噬和先天免疫應答 HPV持續(xù)感染狀態(tài)的建立與逃避先天免疫反應的監(jiān)視有關。先天免疫反應是一種關鍵的宿主防御機制，為抵抗病原體的第一道防線。研究發(fā)現(xiàn)，HPV可通過抑制先天抗病毒免疫逃避被清除的命運[16]。

3.1.1 自噬影響病毒DNA傳感過程 作為一種胞漿DNA感受器，cGAS可識別入侵的病毒DNA并被激活，催化產生cGAMP后與定位于內質網上的干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)結合，易位到高爾基體，招募并激活TBK1以刺激干擾素合成通路，誘導干擾素和其他細胞因子表達來啟動抗病毒反應[17]。Gui等[18]研究發(fā)現(xiàn)，STING還通過一種獨立于TBK1的通路激活自噬過程，即STING結合cGAMP后轉移到內質網-高爾基中間體內，通過依賴WIPI2和ATG5的途徑誘導LC3脂化及自噬體形成。Lau等[19]研究表明，HPV18的E7蛋白可與STING結合，抑制cGAS-STING途徑，拮抗病毒DNA信號的傳感。Lo等[20]研究結果提示，HPV18可通過cGAS-STING途徑持久抑制I型干擾素產生。Gui等研究表明，誘導自噬可能是cGAS-STING信號通路的一種原始功能，但目前尚無研究證實在HPV癌蛋白結合STING后可通過抑制依賴WIPI2和ATG5的自噬過程實現(xiàn)病毒的持續(xù)刺激。

Luo等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HPV16細胞中E7表達使STING水平下降及LC3B-Ⅱ水平升高，而自噬抑制劑的應用可部分逆轉該現(xiàn)象。此外，E7還可通過促進以NLRX1為中心的分子復合物的形成，進一步誘導STING的自噬降解，抑制DNA病毒誘導的免疫活化。以上結果均提示，HPV可能通過自噬影響病毒DNA傳感過程，從而影響病毒的先天免疫應答，維持病毒持續(xù)狀態(tài)。

3.1.2 I型干擾素下游信號通路調控自噬過程 JAK/STAT通路是I型干擾素介導的典型信號通路，誘導抗病毒反應。研究發(fā)現(xiàn)，該通路上的信號分子在多種癌細胞系中促進干擾素應答并誘導STAT1/2依賴的自噬，如在Burkitt淋巴瘤Daudi細胞中，Ⅰ型干擾素以STAT2依賴的方式觸發(fā)自噬[22]；IFN-α激活慢性髓系白血病細胞中的JAK1和STAT1，促進Beclin-1生成[23]。據Gusho等[24]報道，E6、E7蛋白可沉默STAT1等，若恢復STAT1表達，HPV基因組的擴增進程將被阻滯。但尚無直接證據證明HPV持續(xù)狀態(tài)與依賴STAT1/2的自噬過程被抑制有關。STAT1與自噬似乎都在HPV細胞中表現(xiàn)出雙向性。Wu等[25]研究結果顯示，在正常組織、LSIL、HSIL和宮頸鱗狀細胞癌樣本中，HPV16拷貝數和STAT1表達水平均隨著病變進展逐漸增加。而Rajkumar等[26]研究顯示,STAT1在CIN1/2中升高，在CIN3/原位癌中下降，在浸潤性癌癥中顯著增加，提示STAT1可能在感染早期起保護作用，在侵襲階段作為原癌基因起作用。與此同時，Aranda-Rivera等[10]研究表明，HR-HPV在癌癥早期階段抑制自噬以防止病毒清除，在晚期階段誘導自噬為癌細胞提供能量。STAT在HPV持續(xù)感染和細胞轉化過程中與自噬的聯(lián)系及影響，還需更多研究闡明。

Ⅰ型干擾素也影響PI3K/Akt/mTOR通路，mTORC1是自噬啟動的負調控因子。Xie等[27]報道，5-氨基乙酰丙酸光動力療法通過下調PI3K/Akt/mTOR通路，誘導LC3II和p62表達，并通過自噬和凋亡減少HeLa細胞中的病毒載量。綜上所述，HPV可能通過調控Ⅰ型干擾素下游信號通路來調節(jié)自噬，影響干擾素應答，實現(xiàn)HPV持續(xù)感染。

3.2 自噬和DNA損傷修復途徑 HPV影響的DNA損傷修復途徑中以共濟失調毛細血管擴張癥Rad3相關激酶(ataxia telangiectasia and RAD3-related,ATR)和共濟失調毛細血管擴張癥突變蛋白(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)為主，阻滯HPV細胞周期，介導DNA的損傷修復或受損細胞的凋亡衰老[24]。單鏈斷裂產生的異常DNA激活ATR，繼而磷酸化檢查點激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1)并激活其他下游因素。Luo等[28]研究表明，ATR途徑的激活對于HPV基因組的維持和擴增至關重要。Liu等[29]發(fā)現(xiàn)，DNA損傷可使CHK1磷酸化下游的小GTP酶RhoB并增強其與TSC2的相互作用，RhoB/TSC復合物易位到溶酶體，隨后抑制mTORC1活性以啟動自噬。而AKG[30]研究發(fā)現(xiàn)，HPV8蛋白可利用自噬途徑操縱CHK1水平，抑制ATR通路激活。上述研究提示不同HPV亞型影響ATR通路的效應，這些差異可能與不同亞型中E6、E7癌蛋白的功能結構有關。此外，DNA損傷途徑與自噬之間的關系也需更進一步研究。

ATR也具有除DNA損傷修復以外的功能。Hong等[31]研究證實，在HPV陽性細胞中，ATR的激活可觸發(fā)選擇性自噬蛋白p62磷酸化，介導GATA4的自噬降解，抑制免疫反應中許多炎癥基因的表達、減少IFN-κ產生，從而達到HPV病毒擴增的目的。

4 小結

綜上所述，HPV可通過不同的機制影響自噬，兩者間的相互作用十分復雜。HPV持續(xù)感染主要與先天免疫應答的抑制和DNA損傷修復途徑的激活有關，而關于HPV持續(xù)感染與自噬作用機制方面的研究尚不充分。因此，需更多實驗進一步探究兩者的關系，為HPV持續(xù)感染的治療提供新思路。