楊夢雨，鐘 浩，楊 開，孫玉敬，劉曉鳳，關榮發(fā)

（浙江工業(yè)大學食品科學與工程學院 杭州 310014）

如果一種食物被證明能夠有利于身體的1 個或多個目標功能，且不僅具有足夠的營養(yǎng)效果，而且與改善健康和福祉或降低患病風險有關，那么它就可以被視為“功能性”[1]。食品功能性成分是正常飲食的一部分，它們不是藥物或其它膳食補充劑，功能性食品之所以能發(fā)揮功效，均來源于其豐富的活性成分[2]。近年來，食品工業(yè)中功能性食品的開發(fā)和商業(yè)化趨勢日益高漲，功能性食品提取物（如蘋果皮、黑胡蘿卜、米糠）正被用于藥代動力學研究和臨床實踐[3]。這些物質(zhì)能否在人體內(nèi)產(chǎn)生功效，首先在于它們能否被充分吸收利用。然而，由于功能性食品提取物分子質(zhì)量大、結構復雜、理化性質(zhì)特殊，受到人體發(fā)育屏障的限制，阻礙了這些功能性食品提取物的吸收，因此，研究這些功能性食品提取物的吸收代謝機制，及其在人體內(nèi)的作用方式勢在必行。

Caco-2 細胞培養(yǎng)模型，人結腸腺癌細胞系，被廣泛用于評估Caco-2 細胞對藥物和化學物質(zhì)的攝取和生物利用的有效性。在體外培養(yǎng)過程中，形成單細胞層后，自發(fā)地進行上皮樣分化，具有微絨毛結構、刷狀邊緣以及細胞間緊密連接等類似于人類小腸黏膜細胞的結構，可以模擬體外培養(yǎng)的人腸上皮的結構和功能[4-6]。Caco-2 細胞培養(yǎng)模型在研究營養(yǎng)素或藥物吸收、轉運和代謝方面都極為重要，在功能性食品中也得到廣泛的應用。然而，Caco-2 細胞模型與人類上皮細胞存在差異。例如，Caco-2 細胞模型的細胞旁途徑滲透率低于人類上皮，由于缺乏足夠的黏液層，很容易允許高度擴散的小分子通過微絨毛滲透[7]。近年來，多方機構和人員在原始的模型基礎上不斷改進，建立了新的Caco-2 模型，例如：加速Caco-2 滲透性模型[8]、TC-7 細胞模型[9]以及包含75%Caco-2 細胞和25%HT29-5 M21 細胞的共培養(yǎng)體系[10]。這些模型雖然對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗會有所增加，但是對生物有效性的預測準確度得到提升。

一般來說，Caco-2 細胞在培養(yǎng)后7 d 開始分化，分化完成約21 d。短期培養(yǎng)獲得的未分化Caco-2 細胞通常用于研究活性成分的抗癌或抗氧化活性，而分化后的Caco-2 單層細胞由于形態(tài)、標志酶的表達，以及與人小腸相似的通透性特征而被用于體外模擬腸道[11]。此外，由于分子生物學的發(fā)展，分化的Caco-2 細胞模型得到極大的發(fā)展。例如，用微流控細胞培養(yǎng)技術建立2D 或3D細胞模型、共培養(yǎng)模型等[12-14]。這不僅克服了傳統(tǒng)模型的局限性，而且進一步拓寬了食品因素與腸道相互作用的應用范圍。本文綜述功能性食品提取物在Caco-2 細胞模型上的吸收、轉運、代謝和功能評價等方面，以及Caco-2 模型的培養(yǎng)方法和共培養(yǎng)研究進展，概括功能性提取物在Caco-2 模型中的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功能性機制，以及應用中面臨的挑戰(zhàn)。

1 Caco-2 細胞分化模型建立

1.1 Caco-2 細胞培養(yǎng)方法

1.1.1 在普通平板培養(yǎng)皿上培養(yǎng)Caco-2 細胞Caco-2 細胞在用于研究吸收代謝機制和功能評價之前，需要進行傳代培養(yǎng)。一般在37 ℃、5%CO2的潮濕環(huán)境中，于含有不同濃度和比例的胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素、鏈霉素等培養(yǎng)液的MEM（低限量Eagle 培養(yǎng)基）或DMEM（Dulbecco改良的Eagle 培養(yǎng)基） 上生長，在培養(yǎng)瓶中傳代20～60 代，細胞融合80%～90%。據(jù)各項研究表明[15-16]，Caco-2 細胞培養(yǎng)分為以下步驟：

1） 培養(yǎng)液與緩沖溶液的配制 培養(yǎng)液用MEM 或DMEM，緩沖液用標準Hanks 平衡鹽溶液（HBSS）和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化液。

2） 細胞的復蘇 從液氮罐中取出細胞冷凍管，解凍后離心，加入培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

3） Caco-2 細胞的傳代 細胞生長到高密度時，需要分至新的培養(yǎng)瓶中，加入消化液漂洗細胞后，置于37 ℃消化，終止消化后，用吸管吹打脫壁，將細胞分瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4） Caco-2 細胞的凍存 加入適量凍存培養(yǎng)液，計數(shù)后調(diào)整最終密度裝入凍存管，按照標準凍存程序存入液氮罐中。

1.1.2 在Transwell 上培養(yǎng)Caco-2 細胞 用于建立Caco-2 細胞模型的Caco-2 細胞一般在第20～60 代之間[17]，在大多數(shù)試驗中，Caco-2 細胞的培養(yǎng)密度小于2.5×105個/cm2，因為密度太大容易導致大量細胞死亡。Transwell 這項技術的主要材料是Transwell 小室，其外形類似于一個可放置在孔板里的小杯子，Transwell 的命名也由于廠家不同而不同，并且可以用不同材料、不同尺寸的小室來進行不同的試驗。杯子其余部分的材料與普通的孔板類似，最大的不同是杯子底層有一張有通透性的膜。這層膜上的微孔大小大約在0.1～12.0 μm之間，根據(jù)不同試驗要求可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜。Caco-2 細胞培養(yǎng)模型見圖1。當把Transwell 小室放在培養(yǎng)板上后，小室內(nèi)叫做上室，培養(yǎng)板內(nèi)叫做下室，分別裝上、下層培養(yǎng)液，以聚碳酸酯膜相隔。運用不同薄膜和不同孔徑可以研究共培養(yǎng)、細胞遷移、細胞侵襲等[18]。此外，由于Caco-2 細胞模型要求細胞不能穿過多孔膜，因此通常選擇孔徑為0.44 μm 的膜。將Caco-2 細胞以約1×10 個/mL，每孔0.5 mL 的密度接種在Transwell 內(nèi)培養(yǎng)21 d 左右。Transwell 小室一般用于研究生物活性物質(zhì)在Caco-2 細胞中的轉運吸收機制，測定細胞活性，評價抗炎、抗氧化等功能性。例如，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，因為不研究細胞的運動能力，因此可以選擇小于3.0 μm 的孔徑，細胞不會通過薄膜。將2 個細胞分別種于上室和下室，可以研究下室細胞分泌的物質(zhì)對上室物質(zhì)的影響[19]。

圖1 Caco-2 細胞培養(yǎng)模型Fig.1 Conventional Transwell plate and schematic diagram of Caco-2 cell model

1.2 Caco-2 細胞Transwell 模型的評估

細胞極性可以通過檢測細胞絨毛膜表面標記酶的活性，或者通過光學或電子顯微鏡觀察分化標記結構的形成來確認[20]。轉化酶、乳糖酶、異麥芽糖酶和堿性磷酸酶是小腸刷狀緣細胞的標志酶，它們的活性在一定程度上反映了Caco-2 細胞分化的程度[21]。電子顯微鏡（TEM）可以直接觀察到單層頂端微絨毛和細胞間緊密連接的形成過程。光學顯微鏡下可觀察到單分子膜的形成過程[22]。

Caco-2 單層的完整性和滲透性可以通過Millicell 伏特歐姆計和STX 100C 電極測量的跨上皮電阻（TEER）值進行評估[23]。因為該值準確度比較高，所以廣泛用于評估Caco-2 單層的完整性。當單層膜的TEER 值大于300 Ω 時，Caco-2單層可用于進一步試驗[24]。

此外測定暴露標志物的跨膜通量也能反映單層的通透性，常用的標志物有甘露醇、菊粉、聚乙二醇、熒光黃等，甘露醇滲透性的變化是一個比較敏感的細胞單層完整性標志[25]。在實驗室中，一個完整的Caco-2 細胞單層的[14C]甘露醇通透性通常為（1.2±0.5）×10-7cm/s，認為滲透系數(shù)大于5×10-7cm/s 表示細胞單層受損，大于1×10-6cm/s 表示細胞單層對類藥物化合物的破壞完整性。以甘露醇的低通透性（＜0.5%/h）作為評價Caco-2 單層完整性的標準[26]。

轉運效率（Papp）可以用來評估細胞模型的轉運效率，該參數(shù)描述了分子穿過細胞屏障每單位面積所經(jīng)過的通量，Papp 與細胞緊密性和表面轉運蛋白有關，Caco-2 細胞中Papp 的值較低，可能是因為緊密連接較窄，吸收轉運蛋白的表達較低[27]。

總之，隨著Caco-2 細胞的生長和分化，單層細胞的TEER 值以及細胞內(nèi)標志酶的表達和活性逐漸增加，而單層細胞對標志物的通透性逐漸降低。所有這些信號表明Caco-2 細胞已經(jīng)分化，Caco-2 細胞模型已經(jīng)可以用于實驗。

2 功能性食品提取物在Caco-2 細胞中的應用

2.1 功能性食品提取物在Caco-2 細胞模型中的抗炎作用研究

分化的Caco-2 細胞模型是研究功能性食品提取物抗氧化、抗癌和抗炎活性非常合適的模型。炎癥反應的初始階段包括巨噬細胞的激活，導致細胞因子的分泌，如IL-1β、TNF-α 和IL-6，或IL-10，它們是促炎因子，具有抗炎活性[28]。根據(jù)反應機制可知，提高抗炎作用的機理是減少促炎因子的釋放，抑制促進促炎因子釋放的酶的活性，抑制信號通路等。有研究利用雙孢蘑菇提取物處理受脂多糖（LPS）和TNF-α 刺激的Caco-2 細胞，可顯著降低環(huán)加氧酶COX-2 和前列腺素PGF-2α受體的表達。而蘑菇提取物能增加Caco-2 細胞核轉錄因子Nrf-2 的表達，降低IL-6 水平。Caco-2細胞膜中多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的含量發(fā)生了顯著變化。這些結果表明，雙孢蘑菇生物量提取物具有抗炎特性[29]。許多飲食成分，如植物化學物質(zhì)，在抗炎方面發(fā)揮著重要作用，如肉桂中的肉桂酸和肉桂醛具有抗炎活性。在腸上皮Caco-2 細胞和RAW264.7 巨噬細胞的共培養(yǎng)模型中發(fā)現(xiàn)，肉桂醛抑制LPS 刺激的巨噬細胞產(chǎn)生NO、TNF-α和PGE2，阻斷LPS 刺激的巨噬細胞的炎性細胞因子水平和iNOS、COX-2、NF-κB 和IκB 的蛋白表達，肉桂酸對Jnk、NF-κB、IKKα/β 和p38MAPK 的磷酸化均有抑制作用。肉桂醛還能降低NFκB、IKKα/β 和p38MAPK 的磷酸化水平，而不影響JNK 的磷酸化水平[30]。

2.2 功能性食品提取物在Caco-2 細胞模型中的抗氧化活性研究

自由基的產(chǎn)生與人類疾病的發(fā)生有關，維持健康生活依賴于飲食中抗氧化物質(zhì)的供應，抗氧化物質(zhì)可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的自由基過程[31]。大豆被認為是一種很有前景的生物活性肽來源。在人Caco-2 細胞模型中，用H2O2刺激細胞單層，確定了4 個大豆蛋白水解物SPH 組分（SPH-I、SPH-II 和SPH-III）對細胞的抗氧化和保護潛力。SPH-I 和SPH-III 均能減少自由基的產(chǎn)生，而SPH-I 的抗氧化活性最強。氨基酸分析結果表明，SPH-I 富含疏水性和抗氧化性氨基酸，這與其較強的抗氧化活性有關。此外，SPH-I 通過抑制脂質(zhì)過氧化和刺激抗氧化酶活性來保護Caco-2 細胞免受H2O2誘導的氧化應激[32]。食用牡丹花（FDB）不同器官的酚類物質(zhì)組成和抗氧化活性均不同，卵巢表現(xiàn)出最高的DPPH 和ABTS·+自由基清除活性，牡丹雄蕊中的總酚提取物 （TPE） 具有很強的清除活性氧（ROS）的能力，TPE 可以升高TEER 值，增強Caco-2 細胞的屏障功能，增加Caco-2 細胞中ZO-1、CLDN3 和occludin 的mRNA 含量，然而不影響CLDN1 的mRNA 水平[33]。綜上可知，功能性食品提取物在Caco-2 細胞中的抗氧化機理大致為清除活性氧和自由基，提高抗氧化酶的活性等。

2.3 功能性食品提取物在Caco-2 細胞模型中的抗癌和抗增殖研究

癌癥是一種以不受控制的細胞分裂和異常細胞數(shù)量增加為特征的疾病。功能性食品提取物中存在的活性化合物的不同作用機制是促進細胞凋亡、細胞周期阻滯和抑制與癌癥發(fā)病有關的各種信號轉導途徑[34]。水果和蔬菜中存在的各種營養(yǎng)素和植物化學物質(zhì)已被視為潛在的抗癌因子。有研究表明，綠原酸（CGA）是許多人群的主要膳食多酚，咖啡中含有大量綠原酸，有研究表明咖啡攝入量與結腸癌發(fā)生率呈負相關[35]。Caspase-3 的激活是細胞凋亡的確認性標記。在CGA 的細胞中，Caspase-3 裂解的存在證明了這些化合物裂解Caspase-3 的能力。此外，CGA 與其微生物代謝物的結合，在亞毒性濃度下，可以抑制細胞增殖和細胞周期中S 期的進展。在消化過程中，形成的多種多酚代謝產(chǎn)物的組合可以共同發(fā)揮作用，增加抗結腸癌的效果[36]。另外一項研究稱，楊樹是一種預防與飲食有關的慢性疾病的藥物，例如：肥胖癥和糖尿病。楊樹果實中含有多種酚類化合物，主要為綠原酸、原花青素、花青素苷和槲皮素。楊樹酚類提取物作為細胞保護劑，可通過GLUT2 和CD36/FAT 轉運蛋白降低Caco-2 細胞對葡萄糖和游離脂肪酸的攝取，減少誘導氧化應激反應，減少脂質(zhì)蓄積。此外，以最高濃度的化合物進行的溫育會誘導細胞凋亡而不是壞死，這反過來又會減弱炎癥反應，這是由于壞死受損細胞的細胞內(nèi)成分滲漏減少所致，可謂是一項開創(chuàng)性的研究[37]。

圖2 功能性食品提取物在Caco-2 細胞模型中通過線粒體通路誘導細胞凋亡的抗增殖機制[36]Fig.2 Anti-proliferation mechanism of functional food extracts inducing apoptosis through mitochondrial pathway in Caco-2 cell model[36]

2.4 功能性食品提取物在Caco-2 細胞中的降血脂和降糖研究

谷類、水果等功能性食品富含酚類、類黃酮、酚酸、花青素和植物甾醇等植物成分。流行病學研究證明，長期食用谷物可以有效增加脂肪酸結合蛋白的表達，從而顯著減少脂肪堆積，緩解心血管疾病[38]。據(jù)報道，從咖啡漿果中提取的咖啡阿拉伯果肉提取物（CPE）以劑量依賴的方式誘導Caco-2細胞膽固醇膠束轉運顯著減少，CPE 通過下調(diào)NPC1L1 介導的LXR 活化，干擾膠束復合物的形成，來抑制腸道膽固醇吸收，從而在體內(nèi)外發(fā)揮降膽固醇作用[39]。Ⅱ型糖尿病（T2D）是一種缺乏胰島素引起的高血糖為特征的代謝紊亂，DPP4、α-葡萄糖苷酶和谷氨酰胺是T2D 治療最受關注的靶點。燕麥球蛋白的胰蛋白酶水解物在體外具有很強的DPP4 抑制活性，而且在Caco-2 細胞中大量培養(yǎng)（48 h）后，DPP4 蛋白的表達也被下調(diào)，揭示燕麥多肽可能具有促進GLP-1 在人體內(nèi)釋放的巨大潛力，因此燕麥多肽能下調(diào)餐后血糖的水平[40]。總之，功能性食品提取物是通過下調(diào)葡萄糖和膽固醇吸收靶點的表達和上調(diào)轉運蛋白，來起到降糖、降脂的作用。

3 功能性食品提取物在Caco-2 細胞中的吸收、轉運和代謝機制

3.1 吸收機制

表1 在Caco-2 細胞模型中的功能性食品提取物的抗炎、抗氧化、抗增殖、降糖、降脂特性Table 1 Antioxidant，anti-inflammatory，anti-proliferation and anti-cancer properties of functional food extracts （FFEs）using Caco-2 cell line

（續(xù)表1）

食物中的營養(yǎng)素或外源性物質(zhì)在消化系統(tǒng)消化后被吸收到血液中，然后在體內(nèi)重新分布的程度通常以生物利用度為特征。由于一些微量營養(yǎng)素的含量較低，生物利用度與食物的膳食成分、營養(yǎng)素的存在形式以及宿主的生理狀況直接相關[61-62]。小腸對營養(yǎng)物質(zhì)進入血液循環(huán)的吸收主要是由腸道上皮細胞完成的。在分化的Caco-2 細胞模型中，生長在微孔膜上的單層細胞在對應于腸腔的AP 室和對應于腸血管和淋巴循環(huán)的BL 室之間形成屏障[63]。因此，評估目標化合物在分化的Caco-2單層上的吸收是預測其在人體內(nèi)生物利用度的策略之一。

近年來，利用分化的Caco-2 細胞模型進行了大量的生物利用度試驗研究，主要集中在以下幾個方面：

1） 控制被動擴散營養(yǎng)素的生物利用度 微量元素在不同條件下的生物利用度差異很大，例如：為了控制茶葉中氟的生物利用度，在Caco-2細胞模型上評價了茶葉中各成分對氟生物利用度的影響。發(fā)現(xiàn)消化液中的酶和酸可能會影響鋁和氟的結合形式，從而影響氟的吸收。茶葉中的多酚類物質(zhì)EGCG 在高濃度的情況下，也能抑制氟的積累，這對未來研究減少茶葉引起的氟中毒是很有意義的[64]。

2） 營養(yǎng)分子前體吸收評價 一項研究把姜黃素包埋在固體脂質(zhì)納米粒（SLN）中，包埋在SLN中的姜黃素在消化后，大部分被溶解在混合膠束中，混合膠束的大小和表面電荷影響它們在體外通過黏液覆蓋的小腸上皮的通透性，由于膠束的中性表面電荷，固體脂質(zhì)納米粒中的姜黃素迅速滲透到上皮細胞，使在大鼠模型中的生物利用度比姜黃素溶液中的提高了12 倍以上[65]。

3） 營養(yǎng)物質(zhì)相互作用對生物利用度的影響

基于分化的Caco-2 細胞模型的研究表明，營養(yǎng)素的生物利用率在很大程度上取決于食品-食品的協(xié)同作用。制備了天然酪蛋白酸鈉-維生素A復合物（NaCAS-VA）和改性酪蛋白酸鈉-維生素A 復合物（SNaCaS-VA）等多種復合物，在整個消化過程中，監(jiān)測含酪蛋白和各種酪蛋白酸鈉-維生素A 復合物的消化液中維生素A 的含量。研究結果表明，不同乳蛋白維生素復合體的維生素A 攝取維生素的能力高于游離態(tài)的維生素A[66]。

4） 營養(yǎng)物質(zhì)結構與生物利用度的關系 一項研究對紫肉甘薯（PFSP）花色苷的胃腸道生物利用度進行了測定，并與紅酒花色苷的生物利用度進行了比較。紅葡萄酒中的花色苷主要是C3 單葡萄糖苷，而PFSP 中的花色苷中同時含有糖苷和二葡糖苷部分，與不太復雜的紅葡萄酒花色苷相比，?；ㄉ諏φw模擬消化表現(xiàn)出更高的抵抗力，在腸道水平的降解率分別約為30%和45%[67]。

5）胃腸消化對營養(yǎng)物質(zhì)生物利用度的影響 Caco-2 細胞分化模型常被用來預測消化產(chǎn)物的生物利用度，特別是各種食物蛋白中的多肽。大豆蛋白水解物中含有具有較高生物利用度的抗氧化肽，可作為功能性食品原料的潛在來源。類似的試驗表明，Stracchino （典型的意大利軟奶酪）和mbc （一種獨特的受保護原產(chǎn)地標識水牛奶產(chǎn)品）具有良好的穩(wěn)定性和生物利用度，是潛在的功能性食品[42，68-69]。

3.2 轉運機制

基于分化的Caco-2 細胞模型，不僅可以評估食物中營養(yǎng)物質(zhì)和外源物質(zhì)的生物利用度，而且可以研究特定條件下的膜轉運機制。小腸內(nèi)營養(yǎng)素的膜轉運可通過以下4 種方式中的1 種或多種實現(xiàn)：被動擴散、細胞旁轉運、載體介導轉運和內(nèi)吞作用[70]。

利用Caco-2 細胞模型對沒食子酸的吸收轉運方式進行了研究，它的轉運方式以被動方式為主，同時沒食子酸在Caco-2 細胞的轉運受濃度、溫度、pH 值及P-gp 抑制劑的影響，P-gp 參與了沒食子酸的轉運[71]。用兩種不同吸收機制（內(nèi)吞作用和細胞旁途徑） 的特異性抑制劑或增強劑（Wortmannin 和細胞松弛素D） 評價燕麥醯胺（AVNs）的潛在轉運途徑。結果顯示，在細胞松弛素D 存在下，3 種AVNs 的Papp 值均顯著增加，加入Wortmannin 后無明顯變化。表明這3 種AVNs 是通過細胞旁途徑吸收的[72]。鉤藤堿在Caco-2 細胞模型的吸收規(guī)律研究中，對影響鉤藤堿在Caco-2 細胞模型上轉運特征的因素（包括濃度、時間及跨膜轉運蛋白P-糖蛋白）進行考察，當加入P-糖蛋白抑制劑后，藥物由BL 側向AP 側的轉運量顯著減少，而由AP 側到BL 側的轉運量顯著增加。鉤藤堿在Caco-2 細胞上轉運存在一定的濃度及時間依賴性，且P-糖蛋白介導鉤藤堿在Caco-2 細胞上轉運[73]。通過測定豌豆鐵蛋白在胃pH 條件下的穩(wěn)定性并闡明Caco-2 細胞攝取鐵的機制，評價了豌豆鐵蛋白作為食物補充劑的作用。網(wǎng)狀蛋白介導的內(nèi)吞抑制劑（氯丙嗪）使鐵蛋白通過Caco-2 細胞的轉運降低了30%。網(wǎng)狀蛋白介導的內(nèi)吞作用被認為是豌豆鐵蛋白進入Caco-2 細胞單層的轉運途徑[74]。

3.3 代謝機制

圖3 羥基肉桂酸在Caco-2 細胞模型中的代謝機制[76-77]Fig.3 Metabolic mechanism of hydroxycinnamic acid in Caco-2 cell model[76-77]

利用分化的Caco-2 細胞模型證明溶血磷脂，如溶血磷脂酰膽堿，在被腸上皮細胞吸收之前由腸道以2 種方式代謝，包括代謝酶的分泌和代謝酶的頂端選擇性表達[75]。羥基肉桂酸是一種重要的抗氧化劑，其在分化的Caco-2 細胞中的代謝表明其代謝途徑分為I 期脫酯和II 期向頂端排泄2個階段。研究結果還表明，腸上皮中的硫酸化可能是羥基肉桂酸的最初代謝途徑。它主要被水解，然后甲基化。硫酸化被認為是Caco-2 細胞單層的重要代謝途徑。原則上，Caco-2 細胞單層可以形成羥基肉桂酸的葡萄糖醛酸和硫酸鹽結合物[76-77]。腸上皮代謝是由I 相和II 相代謝酶引起的。存在于小腸上皮細胞的各種酶系統(tǒng)是口服藥物的第1 道代謝屏障，其中包括I 相代謝酶（細胞色素P450等）及Ⅱ相代謝酶。這些酶可以減少藥物的口服生物利用度，并且與藥物相互作用及藥物生物利用度的個體差異有關[78]。

4 分化Caco-2 細胞模型在食品-腸道相互作用研究中的應用前景

4.1 改變滲透系統(tǒng)的組成以校正生物利用度

當通過分化的Caco-2 細胞模型預測營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度時，結果容易受到許多因素的影響，如受試者的理化性質(zhì)、單層面積、pH 梯度以及與塑料裝置的非特異性結合，這些因素可能會導致體內(nèi)和體外實驗結果不一致[79]。例如，脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)只有在與腸上皮細胞中的乳糜微粒結合時才能被吸收，而在正常細胞培養(yǎng)條件下，Caco-2細胞不能分泌乳糜微粒[80]。為了解決這個問題，有科學家研究Caco-2 細胞對多種類胡蘿卜素的腸道吸收時，在分化的Caco-2 單層的AP 側添加了油酸、牛黃膽酸和3H-甘油，并成功地建立了Caco-2 細胞分泌富含甘油三酯的脂蛋白模型[81]。另一項研究用仿生工程細胞外基質(zhì)（ECM）代替標準Caco-2 細胞模型中的膠原基質(zhì)。ECM 含有來源于小腸ECM 蛋白的模塊化蛋白結構域。在這個改進的Caco-2 模型中，體內(nèi)通過細胞旁運輸?shù)奈镔|(zhì)的轉運速率顯著提高[82]。這些方法都提高了分化的Caco-2 細胞模型對生物利用度預測的準確度。

4.2 利用分子生物學研究轉運蛋白或代謝酶

研究表明，Caco-2 細胞單層轉運蛋白、代謝酶和核受體的表達與小腸的表達不完全一致。與人類小腸和大腸相比，一些外排轉運蛋白在Caco-2 單層中表達不足，其中乳腺癌耐藥蛋白BCRP（ABCG2）在Caco-2 細胞中的轉錄水平比在大腸中低100 倍[83]。除了尋找其它合適的腸道細胞模型作為替代方案外，已經(jīng)有多種方法來修改Caco-2 細胞模型，以滿足不同試驗的需要。具體地說，Caco-2 細胞模型常用的修飾方法包括基因修飾、基因敲除、轉染、亞克隆等技術[84-85]。一項研究用人工染色體（HAC）載體構建細胞色素P450（CYP）3A4 和NADPH-細胞色素P450 還原酶（CPR）共同表達的Caco-2 細胞。利用微細胞介導的染色體轉移技術將CYP3A4-CPR-HAC 載體轉入Caco-2 細胞，親本細胞與CYP3A4-CPR-HAC/Caco-2 細胞單層之間具有較高的跨皮電阻（TEER） 值和一定的通透性，CYP3A4-CPR-HAC/Caco-2 細胞中的代謝活性高于已有的表達CYP3A4 的Caco-2 細胞模型的代謝活性，這使得能夠在傳統(tǒng)模型基礎上，更靈敏地檢測代謝物來評估腸道代謝[85]。充分利用現(xiàn)代分子生物學和遺傳信息對Caco-2 細胞中某些蛋白質(zhì)的表達進行暫時或穩(wěn)定的調(diào)控，是今后對該模型進行修正的一種可行而有效的方法。

4.3 細胞共培養(yǎng)更好地模擬腸道細胞的微環(huán)境

4.3.1 Caco-2 細胞與其它細胞共培養(yǎng) 小腸上皮黏液層的形成依賴于杯狀細胞分泌黏液的能力，因此沒有杯狀細胞的單個Caco-2 細胞單層不能形成類似于小腸上皮的黏液層。由于沒有黏膜層，分化的Caco-2 細胞模型的旁路通透性總是低于體內(nèi)[86]。為了使分化的Caco-2 細胞模型能夠形成黏液層，Caco-2 細胞與產(chǎn)生黏蛋白的細胞系HT29-MTX 共培養(yǎng)[87]。用分泌黏液的Caco-2/HT29-MTX-E12 共培養(yǎng)和Caco-2 單層作為體外細胞轉運模型，研究胰島素的通透性，共培養(yǎng)的通透性顯著大于Caco-2 細胞單層[88]。應用腸黏膜炎癥模型研究了牛初乳的抗炎和抗菌作用，結果表明，當腫瘤壞死因子（TNF-α）刺激Caco-2/HT29細胞單層時，初乳可降低IL-8 的水平[89]。在研究肉桂酸和肉桂醛抗炎作用時，用到的是Caco-2 和RAW264.7 共培養(yǎng)模型。RAW264.7 對脂多糖非常敏感，LPS 可激活巨噬細胞系RAW264.7，誘導NF-κB 途徑，增加NO 的產(chǎn)生和細胞因子的分泌，如IL-1β、IL-6、IL-8 等。由于Caco-2 和RAW264.7 共用介質(zhì)，LPS 激活的RAW264.7 中的NO 和炎性細胞因子影響Caco-2 單層，通過LPS 和炎性細胞因子的影響抑制屏障功能。將免疫細胞產(chǎn)生的多種細胞因子暴露于上皮細胞可以導致生物反應，而不是只暴露一種細胞因子[30]。

4.3.2 建立3D Caco-2 細胞模型 腸道是一個非常復雜的環(huán)境，多種細胞相互作用以維持正常的腸道功能。一維Caco-2 細胞模型不能準確模擬腸道環(huán)境，不能對腸道細胞間的串擾進行詳細研究。因此，涉及Caco-2 細胞的二維 （2D） 甚至三維（3D）細胞模型開始出現(xiàn)，用于研究腸上皮細胞與其它細胞之間的相互作用。例如，一項研究開發(fā)了一種3D 人體腸道基質(zhì)等效物（3D-ISE），它由人小腸上皮下肌纖維母細胞（ISEMF）嵌入自身細胞外基質(zhì)組成。然后將Caco-2 種植到扁平或圖案化的細胞合成的基質(zhì)等效結構上，并對它們進行培養(yǎng)，直到分化形成良好的上皮組織。結果證明，花紋基質(zhì)增加了吸收表面積、上皮增殖率和微絨毛密度。此外，它還引起上皮細胞生物學功能的改變，如酶和黏液的產(chǎn)生、極化和緊密性。因此它是一個結合三維形貌和充足的間質(zhì)微環(huán)境，具有生理相關特征的三維腸道模型[90]。

4.3.3 建立人體腸道-血管微流控系統(tǒng) 最近世衛(wèi)組織建立了一種新型的人體腸道-血管微流控系統(tǒng)來研究宿主-微生物之間的相互作用。腸上皮細胞（Caco-2）與血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）在蠕動微流控芯片上共培養(yǎng)5 d，在該芯片上建立了大腸桿菌引起的腸道損傷和炎癥反應模型，并評價了干酪乳桿菌和抗生素的治療效果。作為一種傳統(tǒng)的體外腸道吸收模型，Caco-2 細胞通常在Transwell 中培養(yǎng)至少3 周，以分化成具有腸道吸收功能的模型。與之形成鮮明對比的是，這項研究結果顯示周期性蠕動加上微流控裝置中的液體流動，顯著促進了腸上皮細胞的增殖以及糖萼和微絨毛的分泌。此外，芯片上周期性蠕動加液體流動也會影響腸上皮細胞屏障的分化、吸收和代謝功能[91]。與傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法相比，微流控細胞培養(yǎng)有很多優(yōu)點，可以提供一個更接近活體的細胞環(huán)境，以確保得出更可靠的分析結果，在體外研究宿主-微生物相互作用以及微生物群在腸道疾病中的作用和機制方面顯示出良好的潛力。

5 結論

為了分析功能性食品及其提取物用于疾病治療的途徑，需要通過細胞的分析來研究食品與細胞之間的分子機制和相互作用。用Caco-2 細胞單層作為評價細胞模型，可以更方便地研究功能性食品提取物的不同作用機制。在Caco-2 細胞和共培養(yǎng)體系中可以觀察到功能性食品提取物的抗炎、抗氧化和降膽固醇等生物活性。功能性食品提取物在細胞模型中經(jīng)過了吸收、轉運、代謝等轉化，不同的功能性食品提取物具有不同的轉化機制。近期對Caco-2 細胞模型進行了不同方式的改進，可以改變滲透系統(tǒng)的成分組成，來提高生物利用度的準確度，建立的共培養(yǎng)體系更貼切模擬腸道環(huán)境。

Caco-2 細胞可以為功能性食品提取物的研究提供更深入的了解。分化后的Caco-2 細胞表現(xiàn)出小腸上皮細胞的特征，并含有轉運體和藥物代謝酶，如酯酶、氨基肽酶和硫酸鹽。然而，與小腸上皮相比，Caco-2 細胞存在一些缺陷或局限性，如低的細胞旁通透性和高度可擴散的小分子滲入微絨毛等。腸上皮細胞與Caco-2 細胞的主要不同之處在于Caco-2 細胞沒有黏液層。另一個區(qū)別是Caco-2 細胞單層細胞中最重要的代謝酶CYP3A4低表達，CYP3A4 是人體上皮中主要的藥物代謝酶?；虮磉_分析表明，與體內(nèi)環(huán)境相比，Caco-2細胞攝取和外排轉運蛋白的表達減少，從而導致誤差的產(chǎn)生。盡管有這些限制，藥物通過Caco-2單層的滲透特性與其對人體腸道上皮的滲透非常接近。因此，Caco-2 單層是一種強大的體外模型。

鑒于分化后的Caco-2 細胞模型不能完全模擬真實腸道，研究人員從自動化、生物化學、分子生物學和細胞共培養(yǎng)等方面對分化后的Caco-2細胞模型進行了大量的改進。開發(fā)了一種兼具人體腸道上皮特性和對大分子低通透性的共培養(yǎng)體系。雖然共培養(yǎng)體系顯示出很好的重復性，但仍存在載體的高定量表達問題，這可能會消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)和藥物。在未來的研究中，分化的Caco-2 細胞模型應該在具有簡單性和可靠性的情況下更接近內(nèi)部環(huán)境，研究出成本效益高的細胞模型用于大規(guī)模食品-腸道相互作用分析。