鄧夢，關(guān)永林，馬斌祥，張洋，常斌，姚鵬程

1 甘肅中醫(yī)藥大學 甘肅蘭州 730000 2 甘肅省中醫(yī)院 甘肅蘭州 730000

LDH是椎間盤退變、纖維環(huán)破裂、髓核突出，刺激或壓迫神經(jīng)根或脊髓引起的以腰腿痛為主要癥狀的綜合征[1]。研究表明，我國LDH發(fā)病率達7.62%，是造成第三位經(jīng)濟負擔的疾病[2]。LDH包括手術(shù)治療和保守治療，但手術(shù)治療僅少數(shù)病情嚴重患者采用，多數(shù)患者采用保守治療，目前西藥保守治療短期效果較好，但存在較強毒副作用且作用短、費用昂貴、易復發(fā)等缺點[3]。

LDH屬于中醫(yī)“腰痛” “痹證”等范疇，病位在腎、肝，病性是瘀、濕、寒、氣滯[4]，《諸病源候論》記載：“腎氣不足，受風邪之所為也，勞則傷腎，虛則受于風冷，風冷與正氣交爭，故腰腳痛”、“夫勞傷之人，腎氣虛損，而腎主腰腳，其經(jīng)貫?zāi)I絡(luò)脊，風邪乘虛，卒入腎經(jīng)，故卒然而患腰痛”[5]，治療以補腎活血祛瘀為主。中醫(yī)藥在LDH的治療中有不可替代的作用，其中補陽還五湯能補氣活血通絡(luò)，有效緩解患者的癥狀，原方出自《醫(yī)林改錯》，用于治療氣虛血瘀之中風，方中黃芪使氣旺以促血行；當歸活血通絡(luò)；赤芍、川芎、桃仁、紅花活血祛瘀；地龍通經(jīng)活絡(luò)，引諸藥力直達絡(luò)中，全方共奏補氣、消瘀、 通絡(luò)之功[6]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學相關(guān)原理及方法，探討補陽還五湯治療LDH的分子機制，并利用分子對接技術(shù)進行初步驗證，為補陽還五湯用于治療LDH的進一步實驗研究及臨床應(yīng)用提供參考。

資料和方法

1 補陽還五湯有效成分篩選及靶點預測

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫挖掘補陽還五湯中赤芍、川芎、當歸、地龍、紅花、黃芪、桃仁成分及作用靶點，根據(jù)成分毒藥物動力學（ADME）參數(shù)篩選有效成分，將藥物口服生物利用度 （OB）≥30%、藥物相似度（DL）≥0.18定義為篩選條件[7]，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫[8]完成靶點的基因名稱標準轉(zhuǎn)換。

2 LDH疾病相關(guān)靶點獲取

通過OMIM、DrugBank、GeneCards等疾病數(shù)據(jù)庫，以“Lumbar disc herniation”為關(guān)鍵詞檢索LDH相關(guān)靶點，合并刪除重復值，得到LDH疾病相關(guān)靶點。

3 補陽還五湯潛在治療靶點獲取

將復方靶點及疾病靶點導入網(wǎng)站Bioinformatics & Evolutionary Genomics進行venn分析，獲得藥物與疾病交集靶點，認為是復方潛在治療靶點。

4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將潛在靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫[9]，構(gòu)建PP網(wǎng)絡(luò)； 結(jié)果導入至Cytoscape3.7.1通過network analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點度值（Dgree），節(jié)點顏色和大小代表節(jié)點度值，其節(jié)度值越大代表其在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，將節(jié)度值前12位定義為補陽還五湯的關(guān)鍵治療靶點。

5 生物富集分析

將潛在靶點利用RStudio的“clusterProfiler”包進行GO功能和KEGG 通路富集分析，設(shè)定P＜0.05，利用“ggplot2”包對顯著富集結(jié)果進行作圖。

6 疾病-中藥-成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)1.3和1.5分析結(jié)合1.1和1.2的檢索，構(gòu)建疾病-中藥-成分-靶點-信號通路圖，并進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，明確各節(jié)點之間的相互作用關(guān)系。

7 分子對接驗證

將關(guān)鍵靶點及化合物進行分子對接，驗證其相互作用活性。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)從PDB 數(shù)據(jù)庫下載，化合物從PubChem數(shù)據(jù)庫下載。利用Chem3D對化合物進行能量最小化處理，PyMol對蛋白質(zhì)晶體去水、去除雜質(zhì)配體處理，利用AutoDockTool對蛋白質(zhì)晶體及化合物進行加氫、加電荷處理后轉(zhuǎn)為PDBQT格式，利用AutoDockVina進行分子對接，提取對接結(jié)果，利用PyMol對結(jié)合能力較強的進行作圖[10]。

結(jié)果

1 補陽還五湯有效成分及作用靶點預測

獲得藥物有效成分共90個，其中赤芍29個，川芎7個，當歸2個，紅花22個，黃芪20個，桃仁23個（未查找到地龍相關(guān)化合物，故舍棄），利用TCMSP進行有效成分靶點預測，具有作用靶點的化合物共62個，對其進行編碼，見表1。

表1 中藥有效成分及編碼

2 補陽還五湯及LDH相關(guān)靶點預測

通過檢索，獲得補陽還五湯靶點245個，LDH靶點503個，將藥物靶點與疾病靶點取交集獲得共同靶點58個，代表補陽還五湯的潛在治療靶點，繪制venn圖，見圖1。

圖1 藥物-疾病venn圖

3 PPI分析

將潛在靶點上傳STRING繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將結(jié)果利用可視化軟件分析，共58個節(jié)點，1948條作用關(guān)系，Dgree值靠前為IL6、IL1B、TNF等，代表補陽還五湯治療LDH的關(guān)鍵靶點，圖2。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

續(xù)表1

4 生物富集分析

得到GO條目1358 條，其中生物學過程（BP）3308條、分子功能（MF）291條以及細胞組分（CC）185條，顯著富集結(jié)果如圖3所示。潛在治療靶點涉及的 BP 主要包括對脂多糖的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細胞對化學、生物、環(huán)境刺激的反應(yīng)以及細胞增殖的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等。

圖3 GO分析氣泡圖

涉及KEGG通路211條，具有明顯統(tǒng)計學差異包括：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、查加斯病、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、松弛素信號通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、癌癥中的蛋白多糖、類風濕性關(guān)節(jié)炎、百日咳、結(jié)直腸癌、前列腺癌、人巨細胞病毒感染、利什曼病、膀胱癌、Toll樣受體信號通路、肺結(jié)核、內(nèi)分泌抵抗，繪制氣泡圖，如圖4。

圖4 KEGG分析氣泡圖

5 疾病-中藥-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

補陽還五湯有效成分-疾病-潛在靶點-通路網(wǎng)絡(luò)見圖5，共148個節(jié)點，686條作用關(guān)系，補陽還五湯中多個化合物成分，能通過作用于多個靶蛋白調(diào)節(jié)多條信號通路，達到治療LDH的目的。

圖5 疾病-中藥-成分-靶點-通路圖

6 分子對接結(jié)果

關(guān)鍵靶點與化合物分子對接結(jié)果見表2，納入結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol的對接結(jié)果，對對接活性強的前5組進行繪圖，見圖6。補陽還五湯中有效化合物能深入靶蛋白活性位點，并與其關(guān)鍵氨基酸殘基形成極性或非極性鍵，以穩(wěn)定配體和受體的結(jié)合[10]。

表2 分子對接結(jié)果

圖6 分子對接結(jié)果展示

討論

補陽還五湯是治療氣虛血瘀癥的代表方，臨床上能抗炎、減少神經(jīng)細胞凋亡、促進神經(jīng)纖維修復，治療LDH有較好效果[11]。姜文淼[12]等發(fā)現(xiàn)補陽還五湯聯(lián)合艾灸能減輕炎癥反應(yīng)、緩解疼痛、改善腰椎功能。裘興棟[13]等表明電針聯(lián)合補陽還五湯能下調(diào)軟骨終板中VEGF、IL-1β表達水平，增加軟骨終板內(nèi)血管芽數(shù)目、降低鈣化層厚度，延緩椎間盤退變。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，分析補陽還五湯治療LDH的成分及靶點、相關(guān)生物學過程，篩選出補陽還五湯中有效成分62個，作用靶點248個，潛在治療LDH靶點58個。

PPI顯示，補陽還五湯關(guān)鍵靶點包括IL6、IL1B、TNF等。IL-1β、TNF、IL-6 為促炎細胞因子，IL6參與急性炎癥反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)疼痛機制，通過激活MAPK/ERK、成骨分化、STAT3和β-連環(huán)蛋白等信號通路以及干預TIMP-1的活性影響椎間盤功能[14-15]，IL-1β在IVDD期間導致炎癥、基質(zhì)降解、氧化應(yīng)激和細胞凋亡，通過干預NF-KB/p65信號通路，調(diào)節(jié)髓核細胞中的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達[16-17]；TNF-α增加血管通透性，促進破骨細胞增殖，誘導髓核細胞凋亡，引起IVDD[18-19]；AKT1作為一種促生存激酶，調(diào)節(jié)細胞凋亡、血管損傷[20]；MMP9通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解參與IVDD進程，與血液-脊髓屏障、更高的通透性和中性粒細胞遷移等過程有關(guān)[21-22]；VEGF能增加微血管通透性、促進血漿纖維蛋白外滲形成血管、為細胞遷移提供纖維網(wǎng)絡(luò)，誘導椎間盤組織血管生成及浸潤[23]；PTGS2參與炎癥、凋亡和免疫反應(yīng)、細胞因子和趨化因子的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控破骨細胞與成骨細胞的生成和分化[24]；TP53和CASP3誘導細胞凋亡和衰老[25]，趨化因子CCL2、CXCL8在椎間盤突出的疼痛機制中發(fā)揮重要作用[26]。

可視化分析及分子對接結(jié)果表明，山奈酚（Kaempferol）、黃芩素（Baicalein）、β谷甾醇（beta-Sitosterol）、槲皮素（Quercetin）化合物等與關(guān)鍵靶點結(jié)合能力較強，可能是補陽還五湯治療LDH的關(guān)鍵成分，均有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，現(xiàn)代藥理學研究表明，槲皮素通過調(diào)控PI3K/AKT、NF-κB等信號通路抑制細胞炎癥過程[27]；蔡美云[28]等實驗研究表明，山奈酚通過激活p38/ MAPK信號通絡(luò)發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護作用，鄒雪蓮[29]等研究表明山奈酚作為Nrf2激活劑參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高細胞對氧化損傷的保護作用；黃芩素可通過上調(diào)miR-29a-3p的表達來抑制MAP2K6的磷酸化，以提高骨細胞活性、抑制細胞凋亡[30]；β-谷甾醇能提高OPG與ODF的比值，調(diào)節(jié)骨代謝平衡，調(diào)控VEGF抑制滑膜血管生成，減少關(guān)節(jié)腫脹和破壞，具有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛抗炎等作用[3，31]。

生物富集分析表明，補陽還五湯治療LDH涉及多條信號通路，其中與LDH關(guān)系密切的包括：糖尿病并發(fā)癥中的 AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路等。AGEs和RAGE的組合可以激活NF-KB、絲裂原激活的蛋白激酶或JAK/STAT途徑，以參與炎癥、增殖和運動，同時AGE-MG-H1的積累與IVDD中軟骨內(nèi)骨化、肥大和成骨分化有關(guān)[25-32]，TNF和IL-17途徑在IVDD的進展中起著協(xié)同作用，主要通過促進炎癥因子的釋放、NPC的凋亡和ECM的降解[25]，IL-17A通過促進炎癥反應(yīng)、加速ECM降解、誘導血管生成和新神經(jīng)支配來影響IDD，也可以降低、調(diào)節(jié)IDD細胞的自噬水平[33]。TNF信號通路刺激破骨細胞分化和活化，引起骨丟失，刺激滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產(chǎn)生降解軟骨的蛋白酶，導致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞[34]，Toll樣受體（TLRs）能通過NF-κB、MAPK等通路調(diào)控基質(zhì)降解酶、TNFα、IL等炎癥因子參與IVDD，有研究在小鼠的椎間盤中注射MyD88抑制劑后，能夠消除炎性介質(zhì)LPS、IL-1B等引起的TLR2上調(diào)，并可降低MMP1、MMP13、 ADAMTS4和ADAMTS5的 表 達，證 明 了TLR2通過MyD88依賴途徑參與了IDD[35]。

綜上所述，補陽還五湯通過山奈酚、黃芩素、β谷甾醇、槲皮素等化合物通過AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路等通路，調(diào)控IL6、IL1B、TNF、AKT1、MMP9、VEGFA PTGS2、TP53、JUN、CASP3等、CCL2、CXCL8等細胞因子和趨化因子的表達，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管生成、髓核細胞增殖和凋亡的LDH相關(guān)生物過程。本研究初步挖掘補陽還五湯治療LDH的分子作用機制，可以為進一步實驗驗證提供參考和借鑒。