陳寧寧，應(yīng)新旺，謝慶鳳*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州市中醫(yī)院 康復(fù)科，浙江 溫州 325000;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325000)

卒中是造成全球死亡率和殘疾負(fù)擔(dān)增加的重要因素[1]。缺血性卒中是指腦的供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死，是最常見(jiàn)的卒中類型[2-3]。膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)了缺血性卒中損傷后的炎性反應(yīng)。缺血性卒中后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP以及小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物Iba1表達(dá)會(huì)上調(diào)[4]。有研究表明，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活能發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。小凹蛋白1(caveolin1，Cav1) 是一種完整的膜蛋白，是細(xì)胞膜上小窩的主要成分，參與多種細(xì)胞功能，如內(nèi)吞作用、膽固醇穩(wěn)態(tài)、信號(hào)傳導(dǎo)和機(jī)械保護(hù)等[6]。Cav1的磷酸化修飾是Cav1發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)，有研究表明p-Cav1是早期炎性反應(yīng)的重要指標(biāo)[7]。本研究旨在通過(guò)使用Cav1磷酸化抑制劑4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑(4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d] pyrimidine, PP2)探討p-Cav1在腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物： 45只SPF級(jí)2～3月齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(京)2012-0001]。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)同意，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 藥品與試劑：抑制劑PP2(Cosmo Bio公司)；p-Cav1 (Y14)抗體(Affinity公司)；GFAP、Iba1和Tubulin抗體(Abcam生物技術(shù)有限公司)；Nissl染色試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；Tunel染色試劑盒(Roche生物技術(shù)公司)；山羊抗兔/山羊抗小鼠二抗(上海翌圣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理： 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、模型組(model)和抑制劑組(PP2)。每組各15只。模型組用改良 Belayev 法建立大鼠 MCAO 模型。抑制劑組(PP2)在缺血30 min后腹腔注射抑制劑PP2 (1.0 mg/kg)[8-9]，之后每隔24 h注射1次，共注射3次。

1.2.2 mNSS評(píng)分檢測(cè)大鼠神經(jīng)行為學(xué)： 對(duì)腦缺血/再灌注3 d后的大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)、感覺(jué)試驗(yàn)、平衡木試驗(yàn)和反射等方面進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高，代表神經(jīng)系統(tǒng)功能損害越嚴(yán)重。

1.2.3 Nissl染色和TUNEL染色檢測(cè)組織形態(tài): 根據(jù)試劑盒的操作流程分別檢測(cè)各組間的尼氏小體以及細(xì)胞凋亡數(shù)量，然后在顯微鏡下觀察拍照，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 免疫熒光染色定位膠質(zhì)細(xì)胞: 將石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟漂洗之后，用10%山羊血清在室溫下封閉2 h，切片滴加兔抗大鼠 p-Cav1抗體(1∶100)、兔抗大鼠Iba1抗體(1∶100)/小鼠抗大鼠GFAP抗體混合液(1∶100)于濕盒中孵育(4 ℃)16～20 h，在陰性對(duì)照中使用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 代替一抗，其余步驟相同。復(fù)溫漂洗后滴加二抗(混合液孵育2 h(避光環(huán)境)，漂洗后10% DAPI染核5 min(避光環(huán)境)，漂洗后擦干切片滴加防熒光猝滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)p-Cav1、GFAP、Iba1蛋白：用BCA法測(cè)蛋白，以 60 μg蛋白量為標(biāo)準(zhǔn)，以15 μL為上樣量進(jìn)行電泳。用300 mA恒流電轉(zhuǎn)膜約90 min，結(jié)束后先將膜置于1×TBS液中平衡5 min，再置入 5%脫脂牛奶中封閉 2 h。TBST漂洗3次×5 min；加入一抗4 ℃過(guò)夜。TBST漂洗后加入HRP-抗兔/鼠IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL顯影后用Image J軟件對(duì)條帶吸光度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 抑制p-Cav1對(duì)神經(jīng)功能和腦梗死體積的影響

與假手術(shù)組相比，模型組的大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降(P<0.05)。TTC染色結(jié)果顯示模型組梗死灶體積最大，而抑制劑組較模型組明顯下降(P<0.05)(圖1)。

A.TTC staining; B.statistics of neurobehavioral score; C.cerebral infarction volume statistics; *P<0.05 compared with sham group, #P<0.05 compared with model group

2.2 抑制p-Cav1對(duì)梗死灶周圍組織的影響

Nissl染色結(jié)果顯示假手術(shù)組中尼氏體大而數(shù)量多，模型組中則觀察到尼氏體數(shù)量明顯減少(P<0.05)，抑制劑組中尼氏體數(shù)量較模型組增多(P<0.05)(圖2A,C)。TUNEL染色結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，模型組梗死灶周圍組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加(P<0.05)，抑制劑組中凋亡細(xì)胞較模型組顯著減少(P<0.05)(圖2B,D)。

A.Nissl staining, scale bar=50 μm; B.Tunel staining, scale bar=50 μm; C.statistics of number of Nissl bodies; D.statistics of number of apoptotic cells;*P<0.05 compared with sham group, #P<0.05 compared with model group

2.3 腦缺血/再灌注損傷對(duì)梗死灶周圍組織中p-Cav1蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組中p-Cav1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組p-Cav1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)(圖3)。

A.expression of p-Cav1 protein; B.statistics of p-Cav1 relative expression; C.p-Cav1 immunofluorescence staining around cerebral infarction,scale bar=50 μm; *P<0.05 compared with sham group, #P<0.05 compared with model group

2.4 抑制p-Cav1對(duì)GFAP和Iba1蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組中GFAP和Iba1表達(dá)上調(diào)，星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，突起增多，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的距離縮小，相互作用增多(P<0.05)。與模型組相比，抑制劑組中GFAP和Iba1的表達(dá)明顯下降，趨向于假手術(shù)組的細(xì)胞形態(tài)，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用較少(P<0.05)(圖4)。

A.expression of GFAP and Iba1 protein; B.statistics of Iba1 relative expression; C.statistics of GFAP relative expression; D.GFAP/Iba1 immunofluorescence co-staining; E.enlarged result diagram, scale bar=50 μm；*P<0.05 compared with sham group, #P<0.05 compared with model group

3 討論

腦缺血/再灌注損傷后，常伴隨神經(jīng)炎性反應(yīng)的發(fā)生，主要表現(xiàn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活增生及相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。以往研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活增殖，釋放炎性介質(zhì)誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，將新病灶局限化，并通過(guò)膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促使神經(jīng)元修復(fù)；如果損傷刺激未能適當(dāng)控制或持續(xù)存在，將進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，這就是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的雙重作用[11]。最新研究表明，腦缺血再灌注3 d后，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活并伴隨著神經(jīng)功能受損加重[12]。在本實(shí)驗(yàn)研究中，腦缺血再灌注后大鼠的腦組織中GFAP和Iba1表達(dá)明顯增加，伴隨著凋亡細(xì)胞數(shù)量增多。這表明在腦缺血/再灌注損傷3 d后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活會(huì)誘發(fā)神經(jīng)功能缺損。

星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)最重要的兩類膠質(zhì)細(xì)胞，它們?cè)谝欢ǖ牟±項(xiàng)l件下表型會(huì)發(fā)生改變，分泌相應(yīng)促炎因子[5]。有證據(jù)顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用在神經(jīng)炎性反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞可以促使星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用[5]；另一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞也可以刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放更多的促炎因子，介導(dǎo)神經(jīng)毒性反應(yīng)[14]。本研究結(jié)果證實(shí)了在腦缺血/再灌注后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞間的相互作用能誘導(dǎo)神經(jīng)功能缺損。

研究表明 p-Cav1是早期炎性反應(yīng)的重要指標(biāo)[7]。本研究結(jié)果顯示使用p-Cav1抑制劑PP2可以介導(dǎo)腦缺血/再灌注后梗死灶周圍組織中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活及交互作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而體內(nèi)的信號(hào)分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，p-Cav1是否直接調(diào)控還是通過(guò)調(diào)控下游信號(hào)通路間接介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用，還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明抑制p-Cav1可以發(fā)揮腦缺血/再灌注后神經(jīng)保護(hù)功能，其保護(hù)作用可能與減少星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活及相互作用有關(guān)。