曾于恒 林麗珠 吳小云 吳 鋒
潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)為非特異炎性腸病,以腹瀉、便次增多、黏液膿血便等為主要癥狀。至目前為止,其病因和發(fā)病機理尚未完全闡明[1],由于其病變范圍能累及全部腸黏膜,并且病情易反復,遷延難愈,世界衛(wèi)生組織將其歸為難治性疾病,一般認為胃腸道免疫功能的紊亂是其主要病因[2]。流行病學調(diào)查[3]顯示,近年來該病在亞洲的發(fā)病率明顯升高。相關研究[4]表明,TGF-β為多效性細胞因子,具有抗炎活性,TGF-β 的活化與受體結合,TGF-β/Smad7信號通過通路調(diào)節(jié)黏膜免疫作用,促使組織的修復,是治療UC 的關鍵靶標。多項研究表明[5-8],針灸能有效治療UC,本研究通過觀察針灸對UC 的療效,并從黏膜組織基于TGF-β/Smad信號通路方面研究其作用機制。
1.1 實驗動物及分組斯萊克景達公司(湖南省長沙市)提供的40 只SPF 級SD 雄性大鼠(體重:180~200 g),質(zhì)量合格證號為43004700032111,許可證號為SCXK(湘)2014-0002。動物飼養(yǎng)于該公司SPF 級實驗室,溫度為20~26 ℃,相對濕度為40%~70%,適應性飼養(yǎng)1 w后,按隨機分組法,將其分成空白組、模型組、電針組、隔藥灸組各10只。
1.2 實驗用藥及器材TNBS(SLBG2766W);乙醇(國藥集團,批號:20181017);水合氯醛(國藥集團,批號:20200917);石蠟切片機(KW2148,浙江溫州);顯微鏡(奧林巴斯BF52);實時熒光定量PCR儀(艾華德replex3);PCR 擴增儀(Bio-RadT110 thermal cycler);化學發(fā)光凝膠成像(Bio-Rad);臺式高速冷凍離心機(HERNLEZ33HK);核酸水平電泳儀(武漢百達生物BGSUHWIDI);核酸蛋白濃度測定儀(BioDropBD1106);Elisa 試劑盒(重慶基因美生物,批號:E-EL-R0016c、E-AB-16094、E-AB-12904)。
1.3 模型制備禁食、不禁水2 d,空白組予0.6 mL生理鹽水灌腸;其余三組于腹腔用10%的水合氯醛350 mg/kg 進行注射麻醉,用灌胃針取0.6 mLTNBS-50%乙醇造模劑注入肛門8 cm。灌腸后提尾倒置30 s,然后歸籠,取頭低腳高位。模型制備后第2 d,每組隨機選取3 只大鼠,觀察聳毛、拱背、進食和活動等情況,并處死大鼠取結腸組織,觀察結腸病理變化來判定UC模型是否成功[9]。
1.4 干預方法空白組、模型組:無干預。
電針組:造模成功后,將大鼠固定在特制的鼠架上,暴露腹部,根據(jù)《實驗針灸學》[10]選取天樞(雙側(cè))、氣海等穴位(見圖1),天樞穴予毫針刺入13 mm,氣海穴予毫針刺入7~10 mm,接G6805ll 型電針儀,選擇疏密波,20 min/次,每日1次,共14 d。
圖1 大鼠氣海、天樞(雙側(cè))解剖示意圖
隔藥灸組:造模成功后,將肉桂5 g、附子5 g 研末,用黃酒混合調(diào)制,并用模具做成厚度約0.2 cm、直徑約1 cm的藥餅,中間用針刺小孔,將藥餅置于大鼠的氣海穴、天樞穴(雙側(cè)),并選擇清艾條內(nèi)的艾絨制成重約1 g、底面直徑約1 cm 的圓錐形艾炷,隔藥餅灸,每次灸1壯,每日1次,共14 d。
1.5 標本采集干預結束后禁食、不禁水1d,麻醉后解剖腹主動脈,抽取動脈血5 mL,用于ELISA 檢測;取3 cm結腸,剖開,分成2段,1段用于RT-PCR檢測,1段用于HE染色。
1.6 觀察指標
1.6.1 一般情況 整個實驗過程,每日觀察并記錄大鼠精神、活動、體重、飲食、毛色、排便等情況。
1.6.2 大鼠疾病活動性指數(shù)(DAI)評分 參考Mur?thy 標準[11],DAI 評分為干預后大鼠體重下降率、大便性狀、便血程度這3個指標評分的均值。見表1。
表1 大鼠疾病活動性指數(shù)(DAI)評分細則
1.6.3 結腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)評分 根據(jù)結腸黏膜的病理改變情況來進行評分。0分為結腸黏膜無損傷;1 分為結腸黏膜輕度水腫,無潰瘍;2 分為結腸黏膜充血且粗糙呈顆粒狀;3 分為結腸黏膜形成<1 cm的潰瘍;4分為結腸黏膜潰瘍1~2 cm,但和外周臟器沒有粘連;5分為結腸黏膜潰瘍1~2 cm,腸管增厚,且腸管和周圍臟器粘連嚴重。
1.6.4 病理學觀察 取各組大鼠結腸組織,經(jīng)石蠟包埋切片后進行蘇木素-伊紅(HE)染色,結腸組織通過顯微鏡下觀察病理學改變。
1.6.5 血清TGF-β、Smad7及IL-10表達量 將結腸黏膜置于玻璃勻漿器中,加入PBS 勻漿,離心15 min,取上清液,采用ELISA法,檢測各孔的吸光度值,計算TGF-β、Smad7及IL-10表達量。
1.6.6 結腸組織 TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA 表達量 采用RT-PCR 法檢測。步驟:取100 mg 組織于EP 管,加1 mL Trizol 勻漿、200 μL 三氯甲烷,離心,取500 μL上清液于新EP管,加500 μL異丙醇,離心15 min,棄上清液,取RNA 沉淀干燥至透明狀,加150 μL RNase,溶解,混勻,取2 μL用于測定RNA濃度、質(zhì)量。當OD260/OD280為1.8~2.0時質(zhì)量較好,取2 μL 進行逆轉(zhuǎn)錄,合成cDNA,用Realtime PCR 檢測。PCR 擴增:95 ℃預變性2 min;95 ℃15 s,60 ℃1 min,40 次循環(huán),凝膠成像儀檢測質(zhì)量。用2-△△Ct方法計算TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA 表達量?;騎GF-β、Smad7、IL-10 的引物序列見表2。
表2 基因TGF-β、Smad7、IL-10引物序列
1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計,各組數(shù)據(jù)均以()表示,多組間數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗后,采用單因素方差分析進行兩組間比較,檢驗水平α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
造模后,空白組大鼠神情自然,靈活度好,肛周毛發(fā)干凈,進食、二便無異常;各模型組大鼠都有聳毛、拱背、進食減少、活動減少甚至不動,伴有稀便。結合病理結果,判定UC造模成功[9]。
2.1 各組大鼠DAI及CMDI評分比較空白組大鼠
DAI、CMDI評分顯著低于其他三組(P<0.05);電針組、隔藥灸組大鼠DAI、CMDI評分均明顯低于模型組(P<0.05);電針組、隔藥灸大鼠DAI、CMDI評分比較,無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表3。
表3 各組大鼠DAI、CMDI評分比較(分,)
表3 各組大鼠DAI、CMDI評分比較(分,)
注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
2.2 光鏡下各組大鼠的結腸病理組織比較空白組大鼠結腸黏膜結構完整,無炎性細胞浸潤、充血;模型組大鼠結腸黏膜結構較模糊,排列紊亂,腺體結構較不完整,大量炎性細胞浸潤,并壞死、出血;電針組和隔藥灸組大鼠結腸黏膜結構相對較完整,明顯黏膜病變減少,腺體排列較連續(xù),少量炎性細胞浸潤。見圖2。
圖2 光鏡下各組大鼠的結腸病理組織(10×10)
2.3 各組大鼠TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA表達量比較模型組、電針組、隔藥灸組大鼠TGF-β mRNA、Smad7 mRNA 及IL-10 mRNA 表達量顯著高于空白組(P<0.05),電針組、隔藥灸組低于模型組(P<0.05)。見表4。
表4 各組大鼠結腸組織TGF-β mRNA、Smad7 mRNA及IL-10 mRNA表達量比較()
表4 各組大鼠結腸組織TGF-β mRNA、Smad7 mRNA及IL-10 mRNA表達量比較()
注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
2.4 各組大鼠血清TGF-β、Smad7 及IL-10 表達量比較與空白組比較,其他三組TGF-β、Smad7及IL-10表達量升高;與模型組比較,電針組、隔藥灸組TGFβ、Smad7及IL-10表達量降低(P<0.05)。見表5。
表5 各組大鼠血清TGF-β、Smad7及IL-10表達量比較(-x±s)
根據(jù)UC的臨床癥狀及體征,當歸屬于中醫(yī)學“泄瀉”“久痢”范疇。《證治匯補》曰:“泄者,大便溏薄;瀉者,大便直下,略分輕重,總屬脾虛?!笨梢姡琔C的發(fā)病根本乃脾胃虛弱[12-14]。劉歡等[15]認為,脾虛不運貫穿于UC疾病過程的各個階段。脾胃虛弱最終可發(fā)展為脾腎陽虛,導致清陽下陷,從而使魄門失主,瀉下無度,發(fā)為久瀉,正如《景岳全書》所言:“脾弱者,因虛易瀉,因瀉愈虛,蓋關門不固,則氣隨瀉去,氣去則陽衰,陽衰則寒從中生……陰寒性降,下必及腎……所以久瀉不愈,必自太陰傳于少陰而為腸澼?!币虼耍琔C病位在腸,與脾、腎關系密切。綜合其病因病機,治療當以溫補脾腎、通調(diào)腸腑為法。
天樞穴歸足陽明胃經(jīng),乃陽明脈氣所發(fā)之處,且其為大腸經(jīng)募穴,參考腑病取募的取穴原則,天樞穴不僅可以有效通調(diào)大腸腑氣、降濁化濕,而且還有益胃健脾、強身止瀉作用?!端貑枴ち⒅即笳摗吩疲骸疤鞓兄?,天氣主之;天樞之下,地氣主之?!闭f明此穴為升清降濁的穴位,可通調(diào)臟腑?!肚Ы鹨健酚涊d:“大便泄數(shù),并灸天樞?!薄夺樉拇笕吩弧靶篂a不止,里急后重……天樞二穴?!薄夺樉拇蟪伞访枋鎏鞓兄鳌爸鞅茧啵篂a……水痢不止,食不下,水腫腹脹腸鳴……冬月感寒泄痢”。氣海穴乃全身氣血匯集之所,可生發(fā)元氣、培元益腎、扶正固本、益氣溫陽?!肚Ы鹨矸健吩弧八沽。臍夂0賶眩龍笾薄懊洕M瘕聚滯下疼冷,灸氣海百壯”。天樞、氣海相配,可以達到溫養(yǎng)脾腎、通調(diào)氣血、調(diào)和陰陽之功效。
電針是將電與針兩種刺激方式相結合而防治疾病的一種方法,可以代替人做較長時間的持續(xù)運針,且能較客觀地控制刺激量。相關研究[16]表明,電針具有促進血液新陳代謝、止痛、調(diào)理人體生理機能等作用。對于本研究中電針治療時所選擇的疏密波,李曉璐等[17]認為,該波形具有增強人體代謝、促進血液循環(huán)、有效改善組織營養(yǎng)、抗炎、消除水腫等功效。
隔藥灸是將中藥及艾灸的優(yōu)勢高度結合的一種灸法。本研究中,藥餅的組成為附子、肉桂,二者皆大熱,味辛,歸脾、腎經(jīng),善補火助陽,相須為用則功效益彰,可健脾溫腎以治其本。其中,附子為補助元陽之要藥,具有溫補腎陽、回陽救逆之功,《本草正義》曰:“附子辛溫大熱,性善走,故為通行十二經(jīng)純陽之要藥?!比夤鹁哂袦亟?jīng)通脈、引火歸元、補火助陽之功效,乃治療命門火衰之要藥,《本草求真》曰其“大補命門相火,益陽治陰”。該法集穴、藥、灸作用于一體,藥物、艾灸對穴位可起到雙重刺激作用。
本研究結果發(fā)現(xiàn),空白組上皮結腸黏膜完整,未見充血、水腫,具有完整的腺體性結構,未見炎性細胞浸潤;而模型組結腸黏膜破損,伴充血,腺體排列紊亂,炎性細胞大量浸潤;電針組、隔藥灸組上皮結腸黏膜組織損傷有不同程度修復,腺體量增多,排列較整齊,炎性細胞明顯下降,表明電針及隔藥灸均能促進黏膜修復且有效抑制炎癥反應。
相關研究[18]表明,在免疫缺陷、易感性基因及環(huán)境等多方面因素綜合作用下,人體分泌過多的炎癥介質(zhì)及炎癥因子,導致大腸黏膜受損,發(fā)為UC。發(fā)病時,黏膜通透性升高,腸內(nèi)物質(zhì)通過黏膜固有層進入,激活免疫,導致炎癥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[19],UC 的發(fā)病機制可能與NOXs 信號通路途徑有關,大量ROS活化產(chǎn)生,使NLRP3 小體激活,導致促炎因子大量分泌,而電針及隔藥灸治療潰瘍性結腸炎可抑制NOXs-ROS-NLRP3 炎癥小體信號通路,從而發(fā)揮作用。TGF-β因子可有效抑制腸道炎癥性反應,誘導免疫耐受性,恢復受損組織,因而可通過TGF-β 信號通路途徑來治療炎癥性腸病[20]。在此通路依賴Smad 途徑,p-Smad2 與p-Smad3 結合,并與Smad4 產(chǎn)生復合物質(zhì),進入細胞核,靶基因進行調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[21]。研究顯示[22],UC腸內(nèi)炎癥性特征由p-Smad2/3表達量降低和TGF-β信號傳導性受損以及Smad7(磷酸化抑制劑)、IL-10 表達升高所引起[23]。本實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠結腸組織TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA及血清中TGF-β、Smad7 及IL-10 的表達量均明顯高于空白組,電針及隔藥灸干預后,這些指標均較模型組明顯降低,表明電針及隔藥灸可能通過TGF-β/Smad7信號通路抑制炎癥性反應,促進黏膜修復。
綜上所述,電針及隔藥灸可促使UC 大鼠結腸黏膜損傷修復,抑制炎癥性反應,其作用機制可能與TGF-β/Smad7 信號通路有關。電針及隔藥灸如何調(diào)控TGF-β/Smad7 信號通路發(fā)揮其治療作用有待今后進一步研究。