張 斌，王依屹，石 磊

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)又被稱為代謝性脂肪性肝炎，其為肝組織病理學(xué)變化與酒精性肝炎相似而無(wú)過(guò)量飲酒史的一種臨床綜合征，好發(fā)于中年，尤其是超重肥胖人群，以肝細(xì)胞大泡性脂肪變伴肝細(xì)胞損傷和炎癥等為主要特征，嚴(yán)重者將進(jìn)展為肝纖維化，甚至肝硬化，嚴(yán)重危害患者身體健康[1，2]。及時(shí)對(duì)NASH患者疾病轉(zhuǎn)歸進(jìn)行預(yù)測(cè)是改善其治療結(jié)局和預(yù)后的關(guān)鍵。目前，臨床對(duì)NASH病機(jī)尚未完全明確，臨床尚缺乏特異性的診斷指標(biāo)[3]。有研究指出，炎癥反應(yīng)和炎性損傷是誘發(fā)NASH 發(fā)生發(fā)展的最主要的原因[4，5]。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)是體內(nèi)重要的抗氧化蛋白，其能通過(guò)抑制TRX介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與NASH發(fā)病可能相關(guān)[6]。NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)參與組成的炎癥小體是細(xì)胞質(zhì)中的一種大分子復(fù)合蛋白，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因敲除對(duì)改善NASH小鼠肝損傷和脂代謝有明確的保護(hù)作用[7]。本研究探討了NASH患者外周血TXNIP/NLRP3水平變化及其臨床意義，旨在為有效診治NASH患者提供更多的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源 2019年1月～2021年1月我院收治的NASH患者150例，男85例，女65例；年齡為33～65歲，平均年齡為(44.21±7.32)歲。符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[8]關(guān)于NASH的診斷標(biāo)準(zhǔn)，入院前未接受過(guò)任何藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：病毒性肝炎或藥物性肝損傷；應(yīng)用過(guò)免疫抑制劑或抗生素類藥物；凝血功能障礙；嚴(yán)重的感染性或血液性疾??；嚴(yán)重的精神障礙；妊娠或哺乳期婦女。另選擇同期在本院體檢的單純性脂肪肝患者45例，男29例，女16例；年齡為35～68歲，平均年齡為(45.04±6.98)歲。兩組年齡和性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。受試者簽署書(shū)面知情同意書(shū)，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核、通過(guò)。

1.2 肝穿刺活檢 常規(guī)進(jìn)行肝穿刺活檢。根據(jù)肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果[9]將NASH患者分為輕度(不合并或僅有輕度的纖維化)、中度(合并顯著的肝纖維化或間隔纖維化)和重度(合并肝硬化)。隨訪12個(gè)月，再次行肝穿刺活檢，判斷疾病轉(zhuǎn)歸(進(jìn)展，為輕度者進(jìn)展為中度或重度，或中度者進(jìn)展為重度，或肝硬化進(jìn)展，和無(wú)進(jìn)展，各病變程度維持原狀或改善)。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)TXNIP/NLRP3水平檢測(cè) 取干凈試管，加Ficoll分離液6 mL，加肝素抗凝。沿管壁用滴管將混懸液緩慢滴加至分層液上層，377 g離心15 min，采集上、中層界面白色云霧層細(xì)胞，移至含5 mL細(xì)胞洗滌液試管中，混勻后107 g離心20 min，反復(fù)洗滌沉淀，得到PBMCs，4℃冷藏備用。按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)并記錄總RNA濃度和純度。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取cDNA，建立20μL反應(yīng)體系，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR。以2-△△Ct表示目的基因與對(duì)照基因表達(dá)的倍數(shù)。引物序列：TXNIP，上游TGGCTGTAACATTCGGAGATTGTGG，下游GCTTCTGGTTGCTGCTGCTGCGGAC；NLRP3，上游AATTGGCAGCAGATCAGGTCTAAGC，下游CATGTCATCTAGCAGAGGAGTGGTTG；β-action參照物，上游CATGTACGTTGCTATCCAGGC，下游CTCCTTAATGTCACGCACGAT。

1.4 血生化檢測(cè) 常規(guī)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兩組血生化指標(biāo)比較 NASH組血清ALT和AST水平顯著高于單純性脂肪肝組(P<0.05，表1)。

表1 兩組血生化指標(biāo)比較

2.2 兩組PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較 NASH組PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值顯著高于單純性脂肪肝組(P<0.05，表2)。

表2 兩組比較

2.3 不同病情NASH患者血生化指標(biāo)和PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較 在150例NASH患者中，經(jīng)組織病理學(xué)檢查，診斷輕度49例，中度68例和重度33例；重度組血清ALT、AST及PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 Mrna和TXNIP/NLRP3比值顯著高于輕度組或中度組，而中度組也顯著高于輕度組(P<0.05，表3)。

表3 不同病情NASH患者血生化和PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較

2.4 不同疾病轉(zhuǎn)歸NASH患者PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較 經(jīng)二次肝穿隨訪，在150例NASH患者中，發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展31例，無(wú)進(jìn)展119例；進(jìn)展組PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值顯著高于無(wú)進(jìn)展組(P<0.05，表4)。

表4 不同疾病轉(zhuǎn)歸NASH患者PBMCs TXNIP/NLRP3水平比較

3 討論

NASH是一種多系統(tǒng)疾病，不僅影響患者肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能，且會(huì)增加心腦血管疾病、慢性腎病和腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。NASH的流行給人們生命健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[10]。目前，對(duì)NASH病機(jī)尚未完全明確，主要涉及“脂質(zhì)代謝失衡”、“胰島素抵抗”、“炎癥反應(yīng)”等機(jī)制。研究指出，NASH發(fā)病與炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗有關(guān)[11，12]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明NASH病情嚴(yán)重程度與脂質(zhì)代謝失衡相關(guān)[13]。近期有報(bào)道指出“炎癥小體激活”可能是初始代謝應(yīng)激和肝纖維化甚至是肝細(xì)胞死亡的重要原因。TXNIP/NLRP3水平是反映機(jī)體炎癥小體激活的重要標(biāo)志物[14]，而本研究通過(guò)檢測(cè)NASH患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TXNIP/NLRP3水平變化，分析了它們與疾病病情程度和是否進(jìn)展的關(guān)系，有望為NASH病情評(píng)估和疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)提供更多的參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，NASH組肝功能指標(biāo)及PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值顯著高于單純性脂肪肝患者，提示NASH患者存在明顯的肝功能損害，外周血細(xì)胞TXNIP/NLRP3水平呈明顯的高水平。NASH患者因脂肪攝入過(guò)多和脂肪代謝的異?；蜻\(yùn)動(dòng)減少，導(dǎo)致脂肪沉積于肝臟，引發(fā)對(duì)肝細(xì)胞壓迫或嚴(yán)重脂肪變損傷。因此，NASH患者存在明顯的肝功能損害[15]。目前，對(duì)NASH病機(jī)的研究尚未完全明確，其中炎癥小體激活被視為是NASH發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)NLRP3炎性小體功能喪失的小鼠經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)后并不會(huì)形成NASH[16]。另有報(bào)道指出，TXNIP分子通過(guò)增加TXNIP mRNA表達(dá)而加重機(jī)體炎性反應(yīng)[17]，這也是NASH患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值較單純性脂肪肝群體明顯增高的主要原因。本研究結(jié)果還顯示輕度、中度、重度NASH患者血清ALT和AST水平，PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值依次明顯增高，提示隨著NASH患者病情加重肝功能損害越嚴(yán)重，同時(shí)患者PBMC TXNIP/NLRP3水平也越高。NASH患者在肝細(xì)胞損傷及膽汁淤積等多種因素作用下，出現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變、細(xì)胞壞死和炎癥反應(yīng)，使得在膠原合成增加的同時(shí)其分解減少，同時(shí)激活人體免疫系統(tǒng)，引起T淋巴細(xì)胞亞群的改變，導(dǎo)致機(jī)體炎癥因子的分泌紊亂，且這種紊亂隨著患者病情程度加重而更為明顯[18]。NASH患者存在持續(xù)的肝臟創(chuàng)傷和修復(fù)過(guò)程，易引起肝臟代謝紊亂，并且易致血脂蓄積，導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的脂肪變性、細(xì)胞壞死，使得肝細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。同時(shí)NASH發(fā)作后肝細(xì)胞脂肪變性加重，從而激發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[19]，而隨著患者病情程度的加重，表現(xiàn)為更為明顯的肝功能損害和外周血單個(gè)核細(xì)胞TXNIP/NLRP3水平的增高。

如果NASH患者診治不及時(shí)易進(jìn)展為肝纖維化或肝硬化。因此，NASH患者疾病轉(zhuǎn)歸是目前臨床重點(diǎn)關(guān)注的項(xiàng)目。盡管上述研究均明確了NASH患者病情程度與血液指標(biāo)的關(guān)聯(lián)。TXNIP/NLRP3炎癥小體與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。早前主要報(bào)道在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病、急性肝損傷、帕金森病等疾病患者有過(guò)研究報(bào)道，近期有報(bào)道指出TXNIP/NLRP3炎癥小體參與慢性阻塞性肺病患者機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程[20]。本研究結(jié)果顯示進(jìn)展期NASH患者PBMC TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值較無(wú)進(jìn)展組明顯升高，提示NASH患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TXNIP/NLRP3水平與肝功能和病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。外周血單個(gè)核細(xì)胞TXNIP/NLRP3水平可能通過(guò)加重機(jī)體炎癥反應(yīng)而促進(jìn)NASH患者病情進(jìn)展。積極監(jiān)測(cè)患者TXNIP/NLRP3水平對(duì)NASH病情評(píng)估有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，NASH患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TXNIP/NLRP3水平與疾病嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。積極監(jiān)測(cè)患者PBMC TXNIP/NLRP3水平對(duì)病情評(píng)估和疾病轉(zhuǎn)歸預(yù)測(cè)都有重要的指導(dǎo)意義。但本研究同時(shí)存在樣本量小和隨訪時(shí)間短等不足，數(shù)據(jù)的同質(zhì)性和異質(zhì)性尚需進(jìn)一步研究證實(shí)，未來(lái)還需延長(zhǎng)隨訪時(shí)間和觀察。