趙建華,周潔,戴杰,丁國輝,徐凌翔,關雪瑩,周濟,4*

(1.南京農業(yè)大學前沿交叉研究院/作物表型組學交叉研究中心,江蘇 南京 210095; 2.南京農業(yè)大學人工智能學院,江蘇 南京 210031;3.浙江大學農業(yè)與生物技術學院,浙江 杭州 310029; 4.英國國立農業(yè)植物研究所/英國劍橋作物研究中心,劍橋 CB3 0LE,英國)

種子是高等植物生存、傳播和繁衍的一種基本形式,既具有抵御不利環(huán)境的形態(tài)結構和生理特征[1],也是維護種質資源的重要形式[2]。種子保存了植物關鍵遺傳信息,亦被稱為“農業(yè)芯片”,對衡量作物品質和農業(yè)生產(chǎn)都具有重要意義[3]。種子在合適的環(huán)境下萌發(fā)和出苗,根據(jù)其萌發(fā)特征可分為吸脹(imbibition)、萌動(radicle emergence)和發(fā)芽(seedling)3個階段,包括種子因吸水體積膨脹的吸脹階段,胚根、胚芽向外生長突破種皮的萌動階段(protrusion,俗稱“露白”),胚根長與種子等長或胚芽長為種子 1/2長的發(fā)芽階段(germination)[4]。種子發(fā)芽是種子生活力(viability)和活力(vigor)的基本表征,量化分析其萌發(fā)過程中的關鍵性狀,為了解不同作物的生存、生長、產(chǎn)量形成及遺傳完整性提供了重要依據(jù)[5]。特別是在全球環(huán)境變化加劇的今天,胚根突破種皮的時間和胚芽生長速率等性狀[6]以及相關趨性[7]往往體現(xiàn)了植物的抗逆性和適應環(huán)境的能力。因此,通過對幼根(radicle)、胚芽(embryonic shoot)和子葉(cotyledon)的表型分析,可為判斷種子在不同環(huán)境下的活力提供依據(jù),進而為研究作物早期萌發(fā)、出苗和品質等重要農藝性狀提供表型組信息[8]。

當前大規(guī)模種子萌發(fā)表型鑒定仍主要依靠人工觀察,限制了萌發(fā)試驗的監(jiān)測頻率、規(guī)模和準確性,因此植物研究領域對自動化表型獲取和高通量鑒定的需求日益增長[9]。近年來,國內外學者結合計算機視覺和機器學習對種子萌發(fā)表型分析進行了很多有益嘗試。例如:Halcro等[10]利用圖像處理、k均值聚類算法和高斯混合方法采集種子的顏色、大小和形狀特征數(shù)據(jù);SeedExtractor[11]和phenoSeeder[12]可以在單一背景下自動化獲取單個種子的二維、三維形態(tài)數(shù)據(jù),但分析速度受限于數(shù)據(jù)采集和處理算法;Vlaminck等[13]利用ImageJ來測量水稻幼芽特征數(shù)據(jù),但分析準確性和通量受限于軟件平臺;GERMINATOR[14]通過胚根和種皮之間顏色的對比度快速鑒定發(fā)芽,但只能應用于相對簡單的萌發(fā)圖像;RGSES[15]通過圖像處理獲得種子顏色、形狀、紋理等特征,并結合人工神經(jīng)網(wǎng)絡技術來預測水稻種子發(fā)芽趨勢,但準確性相對較低;SeedGerm[16]表型平臺利用計算機視覺分析,根據(jù)幼根生長鑒定發(fā)芽和種子發(fā)芽率,進而通過表型性狀鑒定油菜品種的遺傳差異和對萌發(fā)調節(jié)蛋白磷酸酶(HAI3)在染色體上完成定位,但不能對交錯幼根進行分割和動態(tài)分析;SeedQuant[17]結合深度學習和計算機視覺統(tǒng)計發(fā)芽種子,但該算法不能對發(fā)芽后的種子繼續(xù)動態(tài)監(jiān)測;GrowScreen-Agar[18]利用匹配濾波器對未交錯重疊的擬南芥幼苗根冠進行定量分析,并獲得根系結構數(shù)據(jù),但在幼根互相遮擋情況下的分析準確率較低;Gong等[19]基于語義分割算法分割水稻幼苗根系,但只能對單個種子進行分析,且對種子排列要求較高;RootNav2.0[20]利用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡從圖像中獲取復雜根系結構,精確分割根系,但算法計算復雜度高,很難應用于對種子幼根根系的大規(guī)模分析。

目前尚無以分割交叉幼根為目標的種子動態(tài)萌發(fā)表型檢測的相關研究,也未發(fā)現(xiàn)針對從萌發(fā)到胚根出現(xiàn)生長的整個過程來構建量化監(jiān)測平臺的報道。針對現(xiàn)有分析軟件算法在這一研究方向上的不足之處,本研究借鑒SeedGerm的開源軟件包[16]和AirMeasurer的動態(tài)表型分析算法[21],創(chuàng)新地提出了基于幼根分割、根尖點追蹤的種子萌發(fā)動態(tài)表型分析算法。此外,還利用Python編程語言和圖像處理、機器學習等開源軟件庫設計了數(shù)字化性狀提取軟件包,對幼根動態(tài)分割和根尖點追蹤等表型分析難題開展有益研究,為今后大規(guī)模自動化檢測關鍵種子萌發(fā)表型組提供參考。

1 材料與方法

1.1 種子萌發(fā)試驗設置

種子萌發(fā)試驗圖像數(shù)據(jù)于2020年5月至8月完成采集。以小麥(Triticumaestivum)萌發(fā)試驗為例,在發(fā)芽盒底部放置雙層藍色濾紙,并在濾紙上方放置A3尺寸的深藍色或深紅色發(fā)芽紙。研究采用3個弱筋小麥品種,分別為‘揚麥25’‘寧麥26’和‘淮麥30’,于2019年收獲,保存期為1年。如圖1所示:每個品種選取18粒(6行3列)麥粒放置于藍色發(fā)芽紙上,并將固定體積的水加入濾紙中,靜置2 h,待濾紙均勻吸收水分后開始種子萌發(fā)試驗,發(fā)芽盒內溫度保持22～24 ℃,濕度為99%。拍攝和人工試驗數(shù)據(jù)采集周期為7 d。

1.2 算法技術路線

在獲取圖像序列后,本研究構建了自動化分析流程,其技術路線如圖1-a所示。首先,對輸入圖像序列(圖1-b)完成預處理,即通過圖形用戶界面(graphic user interface,GUI;圖1-c)中的顏色空間(color space)獲得種子的前景和背景蒙版(mask)。然后,根據(jù)種子蒙版獲得種子萌發(fā)初始性狀,如種粒長度、寬度等;再通過種子二維骨架追蹤種子尖點,獲得種子萌發(fā)早、后期的相關性狀,如幼根根長、幼根生長速率等。最后輸出種子萌發(fā)性狀的量化分析結果,并存儲在純文本CSV文件中。

圖1 技術路線(a)、數(shù)據(jù)獲取(b)、分析軟件界面(c)以及前背景標注(d、e)和預訓練結果(f)Fig.1 Technical roadmap of research(a),data collection(b),graphic user interface(GUI)of the analysis software(c),data labelling of foreground and background objects(d,e),and pre-training results(f)

1.3 萌發(fā)時間序列圖像采集

為高質量提取種子萌發(fā)性狀,完整記錄整個萌發(fā)試驗過程,本研究對置于半透明塑料發(fā)芽盒中的多個種子進行連續(xù)拍攝,拍攝間隔為1 h,以時序圖像方式記錄種子萌發(fā)過程。拍攝使用PiCamera高清攝像頭(Sony IMX477 sensor,Japan;5M像素),拍攝圖像最大分辨率為2 592×1 944,攝像頭由運行于樹莓派微型單板計算機(PiFoundation,UK)的Python軟件控制(圖1-b)?；跁r序的小麥種子圖像分辨率為 2 130×1 130像素(垂直×水平),每次試驗共采集150～160張圖像,記錄7 d的小麥種子萌發(fā)過程。

1.4 圖像處理和機器學習的軟件實現(xiàn)

性狀分析算法結合了自動化圖像處理、圖論和監(jiān)督式機器學習,通過編程語言Python(3.70)完成算法和各子功能的軟件實現(xiàn)。其中使用的開發(fā)程序庫包括:圖像處理庫scikit-image(0.17.2)和OpenCV-Python(4.4.0.46);機器學習庫scikit-learn(0.23.2);科學數(shù)據(jù)處理庫NumPy(1.19.4)、Pandas(1.2.3)和SciPy(1.5.4);圖形界面庫PyQt5(5.15.2)。以上開發(fā)均通過PyCharm集成開發(fā)環(huán)境(integrated development environment,IDE)完成源代碼編寫和測試,以下提及的各類函數(shù)均基于上述軟件開發(fā)庫完成相應軟件實現(xiàn)(software implementation)。

針對本研究在背景分割時使用的機器學習部分,算法首先自動選擇圖像序列中位于前、中、后3個時間點的圖像作為訓練樣張,然后通過用戶拖動GUI界面(圖1-d)的滑桿對不同顏色空間中的前背景對象進行初始分割(圖1-e)。在得到前景和背景蒙版后,將不同萌發(fā)階段的前景和背景蒙版所包含的像素通過紅、綠、藍(Red-Green-Blue,RGB)和色相、飽和度、明度(Hue-Saturation-Value,HSV)2個顏色空間(共 6個通道)作為機器學習的訓練樣本數(shù)據(jù)集,再通過用戶選擇的監(jiān)督式機器模型進行學習。最后將訓練后的前、背景分割模型應用到整個圖像序列,為后續(xù)的性狀分析提供動態(tài)蒙版(圖1-f)。

1.5 人工檢測和算法評估

在建立人工真實數(shù)據(jù)集(ground truth dataset)時,使用ImageJ軟件對140張隨機選取的萌發(fā)圖像進行人工測量,獲得種粒長、寬、周長、面積、種子露白時間、幼根根長、幼根根生長速率、種子發(fā)芽時間、幼芽芽長、幼芽面積等性狀。將算法獲取的關鍵性狀數(shù)據(jù)如幼根根長、幼根生長速率和幼芽芽長與人工真實數(shù)據(jù)對比完成數(shù)理統(tǒng)計,并使用分析結果中的決定系數(shù)R2和均方根誤差(root mean square error,RMSE)作為算法獲取性狀的評價指標。根據(jù)決定系數(shù)R2確定算法數(shù)據(jù)和人工數(shù)據(jù)的線性回歸關系,R2越高表示 2種數(shù)據(jù)間的關聯(lián)性越高,RMSE越低表示模型誤差越小。相關工作通過微軟Excel(V16)的數(shù)理統(tǒng)計函數(shù)集完成。通過IDE性能分析(Python profiler),本算法處理單張小麥圖像(5 MB)的平均用時為90～100 s,處理1個小麥圖像序列(150～160張)用時210～220 min,占用內存667 MB,程序運行時間和內存消耗與圖像序列大小呈線性關系。

2 結合監(jiān)督式機器學習和自動化圖像處理的種子萌發(fā)表型分析

2.1 圖形用戶界面(GUI)

鑒于開源軟件包SeedGerm[16]界面交互能力不強,本研究使用功能更齊全的PyQt5開發(fā)包[22]搭建種子萌發(fā)表型分析軟件的GUI。GUI集成了本研究的分析算法,可對多物種種子萌發(fā)圖像序列進行批量處理,輸出關鍵萌發(fā)性狀的量化分析和數(shù)字化提取結果,包括種子的長、寬、面積、周長,種子露白時間、萌發(fā)時間,幼根長度、幼根生長速度,幼芽長度等。通過初始界面(圖1-c),用戶可在“圖像路徑”選擇圖像序列,在“品種”下拉列表選擇作物種類(如油菜、小麥或棉花等)。在“數(shù)據(jù)預處理”定義參數(shù),如濾紙面板數(shù)量、發(fā)芽試驗面板中種子的行列數(shù)、開始和結束圖像序號(默認值為所選圖像序列的第一和最后一張圖像)。在“種子提取”的“背景標注”下拉列表中可選擇顏色空間(例如,LAB顏色空間,L代表亮度,A和B代表顏色分量;HSV顏色空間,H代表色調,S代表飽和度,V代表亮度),并通過調整滑桿位置(圖1-d)對背景進行高效人工標注(圖1-e),獲得基于像素的前背景訓練集。

在“種子分割”下拉列表中,可選擇3種為分割幼根幼芽重新訓練的監(jiān)督式機器學習算法,如K近鄰[23](K-Nearest Neighbor,KNN)、支持向量機[24](Support Vector Machine,SVM)和隨機森林[25](Random Forest,RF)。不同機器學習算法可對不同質量圖像的前景(種子、幼根和幼芽)、背景(發(fā)芽紙)的像素簇分別學習,進而得到不同時期種子萌發(fā)的像素特征及其蒙版(圖1-e)。若需對幼根、幼芽特征信息單獨提取,用戶還可在“根、芽提取”部分對獲取的種子蒙版進行操作,提高建立訓練集的效率。

圖2 種子萌發(fā)初始性狀(如穗粒和吸脹特征等)分析(第1小時)Fig.2 Phenotypic analysis of initial seed germination traits such as grain phenotypes and imbibition in the first hour

2.2 種子萌發(fā)初始性狀分析

以下算法解析以對小麥種子萌發(fā)性狀的量化分析和數(shù)字化提取為例展開介紹。對小麥種子萌發(fā)初始階段的性狀分析從第0小時開始,種子經(jīng)歷吸脹到達露白階段初期。如圖2所示:通過一系列圖像處理算法完成對初始萌發(fā)性狀的量化分析。首先,從GUI端口獲取輸入的RGB圖像(圖2-a)和用機器學習算法處理后得到前景(即種子)、背景(即發(fā)芽紙和發(fā)芽盒)蒙版。然后,利用SciPy庫的label函數(shù)和regionprops函數(shù)對種子蒙版(圖2-b)進行篩選,測量并記錄每粒種子的質心坐標(橙色)及其編號(黃色)。雖然種子在吸脹過程中由于自身滾動導致質心位置變化,但在1 h內(拍攝間隔),種子質心位置變化較小,可通過對比2張相鄰圖像中種子的質心坐標完成種子的定位(圖2-c)。

基于獲取的種子質心,使用thin算法提取種子的二維骨架(圖2-d)。若二維骨架的長度變長(超過種子長度1/3)且監(jiān)測區(qū)域中出現(xiàn)白色像素,則判斷種子進入露白階段。對種子的初始性狀分析還包括種子面積、種子輪廓長度(即種子周長)、種子寬度和長度(圖2-e)。這些初始性狀測量基于像素,可通過測量放在發(fā)芽盒中的標尺(如圖2-a白色標簽)完成從像素到公制(如mm)的轉換。

2.3 種子萌發(fā)早期性狀分析和幼根根尖追蹤算法

在種子萌發(fā)早期,種子幼根還未發(fā)生交叉。幼根根尖追蹤算法對這一時期的種子幼根進行的性狀分析主要集中于露白時間、萌發(fā)時間、幼根長度變化等性狀。算法流程如圖3-a所示,首先對種子萌發(fā)圖像(圖3-b)進行前背景分割,獲得每粒種子的質心坐標和編號(圖3-c),然后提取每粒種子及其幼根的二維骨架(綠色;圖3-d),分析其形態(tài)特征。再通過SciPy中的binary_hit_or_miss算法獲得骨架端點,將距離質心遠的端點作為幼根根尖點,并在追蹤算法中記錄根尖點坐標(紅色;圖3-e)。同時,將根骨架沿法線方向到根輪廓的2倍距離作為幼根直徑。最后,對本圖獲得的種子根尖點(淡黃色;圖3-f)與前一張圖像中對應的種子根尖點(紅色;圖3-f)坐標進行比較,并根據(jù)不同時間點的根尖點坐標重建幼根骨架,并根據(jù)重建的骨架長度計算幼根生長速率(圖3-f)。

圖3 分析流程(a)和早期萌發(fā)(激活新陳代謝階段)的種子性狀分析(第38小時)(b—f)Fig.3 Analysis workflow(a)and phenotypic analysis of seed-based traits at the reactivation of metabolism phase(38th hour)(b-f)

2.3.1 幼根根尖點追蹤算法本研究原創(chuàng)的根尖點追蹤算法能夠用于重建幼根骨架,并獲得幼根根長和幼根生長速率。算法對未露白種子i以初始化有向圖Gi(V,E)(空集)表示,當種子露白后以第1次檢測到的根尖點坐標Ci,j初始化Gi的頂點Gi.V,并將Gi.E的邊集合設置為空集,即沒有根骨架。如式(1)所示:

Gi(V,E)={Gi(V,E)|Gi.V=Ci,j,Gi.E=?, ifCi,j≠? andGi(V,E)=?}

(1)

式中:i(1～n,n為發(fā)芽試驗種子總數(shù))為種子序號,j(1～m,m為序列圖像的總數(shù))表示該圖像在圖像序列中的序號;G.V表示有向圖的頂點集合,存放幼根骨架當前根尖點坐標,其中“.”表示對有向圖G中成員數(shù)據(jù)的調用;G.E表示有向圖的邊集合,即幼根二維骨架集合;Ci,j為第j張圖像中檢測到的第i粒種子的根尖點集合。

2.3.2 幼根重建算法根據(jù)第j張圖像檢測到的第i粒種子及其對應的根尖點集合Ci,j,與第j-1張圖像(前一張圖像)中相應的第i粒種子及其對應的根尖點集合Ci,j-1,遍歷同一粒種子i在前后2張圖像中的根尖點集合里的根尖點元素Tk,i,j∈Ci,j和Tk,i,j-1∈Ci,j-1,其中k(1～K,K表示此根尖點集合Ci,j中根尖點總數(shù))為根尖點k在種子i在圖像j里的根尖點集合中的序號。計算Tk,i,j和Tk,i,j-1的距離是否小于20像素(根據(jù)圖像分辨率獲取的經(jīng)驗閾值)。同時,計算相對應的根尖點Tk,i,j-1和Tk,i,j構成的向量和重建骨架的夾角是否大于120°。若以上2項條件均符合,算法將連接2個根尖點Tk,i,j和Tk,i,j-1,以重建線段作為2個根尖點間的幼根骨架,并添加到有向圖的重建根骨架集合Gi.E中。第i個種子在圖像j上檢測到的根尖點及對應幼根骨架重建完成后,用Ci,j替代并更新該種子的有向圖集合Gi.V。如式(2)所示:

(2)

算法對序列中所有圖像中的根尖點都重復上述操作,可對圖像序列中所有可測種子的根尖點完成追蹤并重建幼根二維骨架。IDE性能分析結果顯示,此部分算法對每張圖像的處理時間為25～35 s,運行時間隨圖像數(shù)量增加而線性增加。

圖4 分析流程(a)和基于圖論分割、重建重疊的種子幼根骨架(b—f)Fig.4 Analysis workflow(a)and segment overlapped radicle skeletons using graph theory and skeleton reconstruction techniques(b-f)

2.4 對復雜種子幼根的分割和追蹤

在種子萌發(fā)后期,種子幼根將出現(xiàn)較復雜的交叉重疊現(xiàn)象。針對這一問題,算法首先分割交叉的幼根骨架,再根據(jù)每粒種子的根尖點坐標完成動態(tài)追蹤,按時序重建每粒種子對應的幼根骨架。算法流程如圖4-a 所示,其中對交叉重疊幼根的分割算法主要分為二維骨架分解和重建2部分。

2.4.1 幼根骨架分解算法對重疊種子幼根骨架進行Harris角點檢測[26],篩選合適的角點(2種,分別為“十”字交叉點、“人”字交叉點)作為幼根交叉點(圖4-b紅色像素區(qū)域),選擇交叉點上下左右各8像素作為交叉區(qū)域。分析交叉區(qū)域骨架,分為2種情況:如圖4-c所示,第1種是包含1個交叉點和3個端點的“人”字交叉點;第2種是包含2個交叉點和4個端點的“十”字交叉點。對于第1種幼根交叉方式,分割方法為:連接交叉點(橙色)和3個端點(天藍色),構建3個向量;分別計算向量間夾角([0°,180°])的余弦值,余弦值越小表示夾角越大,連接夾角最大的2個端點構建1條幼根骨架,連接剩下的端點和交叉點構建另一條幼根骨架。對于第2種交叉方式,算法分割方法為:取2個交叉點連線的中點作為新交叉點(橙色),從新交叉點到4個端點(天藍色)連線作為4個向量;計算向量之間的夾角,連接夾角最大的2個端點作為1條幼根骨架,連接剩下的2個端點作為另一條幼根骨架,并分別保存分割后的2條幼根。

去除交叉區(qū)域后剩余幼根骨架不存在交錯重疊(圖4-d),因此可根據(jù)其是否與種皮部分(圖4-d,深藍色)連接分為一級骨架和二級骨架(圖4-e)。將交叉點區(qū)域骨架分解后加入二級骨架集合。

2.4.2 基于種子的幼根骨架重建算法遍歷并計算二級骨架和一級骨架之間距離最近的2個端點,計算2個端點之間線段的距離和2個端點之間線段與一級骨架的夾角。若距離小于距離閾值(即20像素)且夾角大于角度閾值(即120°),則將該二級骨架拼接到對應的一級骨架中。通過以上方法可將全部的一、二級骨架重新拼接(圖4-f),并根據(jù)不同種子的質心和所在骨架區(qū)域對應的種子序號,完成重疊幼根的分割和種子歸屬分析(圖4-g)。根據(jù)種子序號和分割交錯的種子根骨架,再運用2.3節(jié)中的幼根根尖追蹤和骨架重建算法,可追蹤某粒種子對應的所有幼根根尖點,并基于時序完成幼根骨架的重建。

2.5 種子萌發(fā)后期性狀分析

在萌發(fā)后期,種子扎根扶葉,胚芽鞘向上豎起。此時對種子發(fā)芽性狀的量化分析主要集中于幼根長度、根生長速率和幼芽長度等性狀。算法流程如圖5-a所示,首先根據(jù)萌發(fā)圖像(圖5-b)進行前背景分割,對每粒種子的質心坐標和二維骨架完成初始分析(圖5-c)。針對種子幼根骨架交錯重疊問題,利用2.4節(jié)算法分割幼根骨架,從機器學習算法獲取的幼根、幼芽蒙版(圖5-d)中提取幼根(綠色)和幼芽(藍綠色)的二維骨架,基于骨架尖點坐標獲得幼根、幼芽的長度和生長速率(圖5-e)。利用convex_hull_image算法獲得幼根的凸包(convex hull),以凸包中的像素總數(shù)作為凸包面積,即為根面積。利用種子幼芽蒙版的像素總數(shù)作為幼芽的面積。并通過圖像中標尺完成從像素到毫米的轉換。

圖5 分析流程(a)和后期萌發(fā)(即種子萌發(fā)至幼苗發(fā)育階段)的種子性狀分析(b—e)Fig.5 Analysis workflow and phenotypic analysis of seed-based traits during the seed germination(a)and seedling development phases(b-e)

3 結果與分析

軟件處理完圖像序列后,會生成相關性狀的CSV文件,初始性狀包括:種粒的長度、寬度、周長、面積。萌發(fā)早期性狀包括:露白時間、根長、根直徑、根面積、根生長速率、發(fā)芽時間。萌發(fā)后期包括:芽長、芽面積、芽直徑以及對幼根持續(xù)追蹤后的根長、根直徑、根面積、根生長速率。若圖像中包含標尺,算法會將長度單位從像素轉換為毫米。

3.1 種子幼根追蹤算法在動態(tài)表型分析中的應用

以圖像序列3中第16號種子為例(圖6-a),種子露白前持續(xù)分析種粒性狀(圖6-b白色輪廓)。種子露白后,按時序獲得幼根長度和生長速率等性狀(圖6-b粉色)。根據(jù)追蹤結果可以發(fā)現(xiàn),隨著胚根生長,第28小時胚根長與種子等長,標記種子發(fā)芽;第40小時,種子出現(xiàn)2條次生胚根;第60小時,根系出現(xiàn)交叉?；跁r序對所有種子的根骨架重建效果如圖6-c所示,表示第1～72小時幼根生長過程(深藍色為第1小時,深紅色為第72小時)。

圖6 種子幼根萌發(fā)性狀動態(tài)分析Fig.6 Dynamic analysis of the seed-based radicle emergence trait

3.2 萌發(fā)性狀量化分析與人工數(shù)據(jù)對比

以小麥為例,‘揚麥25’‘寧麥26’和‘淮麥30’(分別記為G1、G2及G3)的圖像序列均有3個重復,關鍵性狀量化分析結果如圖7-a、b、c所示,3個小麥品種分別在第56、40、23小時開始露白,此后根長、幼根生長速率和幼根面積穩(wěn)定增長。其中,‘淮麥30’的幼根生長速率和幼根面積增加較快,體現(xiàn)了較好的萌發(fā)性。第120小時左右,‘寧麥26’的幼芽生長速度加快,并快速超越其他2個品種,體現(xiàn)了良好的出芽能力。

將不同重復中獲得的根長、芽長、根生長速率的數(shù)據(jù)通過線性回歸分析與人工測量數(shù)據(jù)進行對比,獲得的決定系數(shù)R2分別為0.922(n=188粒種子,P<0.001,RMSE=1.727)、0.719(n=191粒種子,P<0.001,RMSE=0.406)、0.897(n=115粒種子,P<0.001,RMSE=2.726)。相關性分析結果表明(7-d、e、f),算法計算的幼根和幼芽性狀數(shù)據(jù)與實際性狀數(shù)據(jù)顯著相關,算法能較精確提取小麥種子的萌發(fā)性狀數(shù)據(jù)。

3.3 算法在不同作物種子萌發(fā)試驗中的應用

雖然本算法基于單子葉植物須根系研發(fā),為提高算法的泛化能力,設計算法時也考慮了雙子葉植物直根系的幼根特征。以棉花(Gossypiumbarbadense)和油菜(Brassicanapus)為例,通過簡單參數(shù)調整后,本算法還可動態(tài)分析這2種作物的幼根根長性狀。棉花幼根根長的動態(tài)分析結果(圖7-g)顯示,3個棉花品種的露白時間相差不大,第2個品種(G2)的幼根生長略快。油菜幼根根長的分析結果(圖7-h)顯示,第6個品種(G6)露白時間較晚,幼根在萌發(fā)前期生長較慢,在萌發(fā)后期生長加速;第5個品種(G5)的幼根在萌發(fā)前期生長較快,在后期生長速度減緩。

圖7 性狀量化分析結果(a—c)、線性回歸分析結果(d—f)、算法應用(g、h)Fig.7 The result of traits quantitative analysis(a-c)and linear regression analysis(d-f)nd the application of dynamic detection algorithm(g,h)

4 結論

1)本研究提出的種子動態(tài)萌發(fā)表型檢測算法結合了自動化圖像處理技術、圖論和機器學習算法,即利用監(jiān)督式機器學習算法進行圖像前背景分割,用于不同品種不同背景的試驗圖像;利用自動化圖像處理算法獲取基于形狀和顏色空間的性狀,進而通過圖論算法解決圖像處理和機器學習算法無法解決的根尖點追蹤和交叉根分割等問題,提取種子萌發(fā)過程中的關鍵動態(tài)性狀。在種子相互遮擋或根系交叉情況下,種子動態(tài)萌發(fā)表型監(jiān)測算法仍能對關鍵表型(如幼根和幼芽生長)進行持續(xù)監(jiān)測,為作物遺傳育種和關鍵表型分析提供量化依據(jù)和智能化解析技術,為大規(guī)模種子萌發(fā)表型分析研究提供了新算法。

2)雖然本算法對關鍵動態(tài)性狀如幼根長、幼根生長速率、幼芽長的分析達到92.2%(n=188)、71.9%(n=191)和89.7%(n=115)的相關性,但特征提取精度仍有提升空間,后續(xù)將圍繞這一點展開研究。

3)目前已針對小麥、棉花和油菜3種作物完成了預試驗,后續(xù)將會擴展應用場景,將算法泛化,應用到更多作物上去。本研究表明,分割交叉幼根骨架算法對本文提到的2種交叉方式的分割效果較好,但未針對更復雜的交叉場景進行研究。在今后的研究中,我們將嘗試更多計算機視覺算法,提高算法在復雜幼根交叉情況下的分割效果,更準確測量幼根生長速率,并進一步提高算法的泛化性和魯棒性。