特列克·阿依恒別克,賽福丁·阿不拉,薩比熱·熱夏提, 況玲,德力拜爾·木拉提,阿得力江·吾斯曼*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,新疆 烏魯木齊 830011)

駱駝刺(AlhagisparsifoliaShap)為豆科蝶形花亞科駱駝刺屬的多年生半灌木[1]。我國(guó)駱駝刺主要分布于西北地區(qū)的平原荒漠和半荒漠地帶,尤其在新疆,分布面積達(dá)1.73×104km2[1-2]。駱駝刺含有大量的多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)化合物[2]。駱駝刺糖性熱而燥,能夠滋補(bǔ)強(qiáng)壯,具有澀腸止痛的功效[3]。有關(guān)駱駝刺藥理作用的研究主要集中在駱駝刺分泌的糖分小顆粒刺糖中,研究顯示刺糖多糖具有良好的免疫增強(qiáng)作用,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答,是一種良好的免疫增強(qiáng)劑[4-5]。近幾年來(lái),由于駱駝刺生長(zhǎng)地降雨量的增加，導(dǎo)致秋收時(shí)大量刺糖被雨水溶解滲入土中,使得刺糖產(chǎn)量下降,價(jià)格上漲,影響其作為廉價(jià)免疫增強(qiáng)劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的推廣。

多糖作為天然高分子化合物分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜,多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了多糖功能的多樣性。多糖有增殖免疫、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[6-7]。多糖通常分為中性多糖、酸性多糖和堿性多糖,其中酸性多糖除了含中性多糖的官能團(tuán)外,還常含有糖醛酸、硫酸根等基團(tuán),可增強(qiáng)其生物活性,存在重大的研究和應(yīng)用價(jià)值[8]。因此,尋求植物中具有良好免疫增強(qiáng)作用的多糖成分,研究其免疫增強(qiáng)活性,是將其作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用及推廣的關(guān)鍵。

目前,對(duì)駱駝刺多糖(AlhagisparsifoliaShap polysaccharide,ASP)的研究報(bào)道較多,但對(duì)駱駝刺中多糖成分的分離、鑒定及免疫增強(qiáng)活性作用的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)采用水提醇沉法及柱層析法,分離出駱駝刺中酸性多糖(acidic ASP,aASP)成分,對(duì)其進(jìn)行鑒定,用MTT法、流式細(xì)胞法和ELISA等方法檢測(cè)aASP對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖、T細(xì)胞分化及細(xì)胞因子表達(dá)等作用的影響,旨在檢測(cè)aASP的免疫增強(qiáng)作用并闡明其作用機(jī)制,為研究其增殖免疫活性及新型免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)動(dòng)物

RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、PBS、紅細(xì)胞裂解液、脂多糖(LPS)溶液、植物血凝素(PHA)和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清、雙抗購(gòu)自北京沃比森科技有限公司;分析純二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自天津市金鉑特化工有限公司;IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海凡科維生物科技有限公司;Galaxy 48 R CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自英國(guó)New Brunswick公司;TE2000-W倒置顯微鏡購(gòu)自Nikon公司。Balb/c小鼠:4～6周齡,全雌,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué),試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 駱駝刺酸性多糖(aASP)的提取、分離及純化

稱(chēng)取干燥駱駝刺1 000 g,粉碎過(guò)60目篩,按1∶3的體積比分別經(jīng)過(guò)石油醚及95%乙醇回流,用于脫脂及去除醇溶性小分子,再按1∶9的體積比用去離子水提取粗多糖(80 ℃,3 h),減壓濃縮至1 g·mL-1。按80%體積進(jìn)行醇沉,得到的粗多糖用Sevage試劑,3次重復(fù)脫蛋白。將去蛋白后的多糖經(jīng)過(guò)透析袋透析后去除小分子單糖及寡糖,采用大孔樹(shù)脂AB-8進(jìn)行脫色。將脫色后的粗多糖經(jīng)過(guò)DEAE-52柱(2.6 cm×50 cm,流速為1 mL·min-1)進(jìn)行分離[9],收集洗脫液,經(jīng)苯酚硫酸法檢測(cè)洗脫吸光值(A490),繪制洗脫線,再經(jīng)過(guò)Sephadex G-100(2.6 cm×70 cm,流速0.5 mL·min-1)進(jìn)行純化,得到高純度的aASP。制備1 mg·mL-1的aASP,用含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度備用。

1.3 aASP含量的測(cè)定

苯酚硫酸法建立多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,吸取0、0.2、0.4、0.6和0.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,以蒸餾水補(bǔ)至2 mL,各試管加入5%苯酚和濃硫酸,紫外可見(jiàn)光譜490 nm處檢測(cè)aASP的糖含量[10]。硫酸-咔唑法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制40 μg·mL-1葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液,分別取0.1、0.25、0.50、0.75和 1 mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液于試管中,補(bǔ)水至1 mL,每孔加入125 μL硼酸液,紫外可見(jiàn)光譜530 nm處檢測(cè)aASP的糖醛酸含量[11]。BCA微孔酶標(biāo)儀法:按50∶1體積比配制BCA工作液,取10 μL BCA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100 μL,使終濃度為0.5 mg·mL-1,作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別將標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照0、2、4、6、8、12、16和20 μL加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)瓶中,加PBS補(bǔ)足至20 μL,各孔加入200 μL BCA工作液,常溫放置15～30 min,在562 nm處測(cè)定aASP中的蛋白含量[12]。

1.4 aASP的紅外光譜測(cè)定

按照KBr壓片法的制備[13]流程,將aASP置于常壓干燥器中過(guò)夜,將干燥的aASP按1∶100的質(zhì)量比與KBr粉末混合,研磨壓片,用紅外光譜儀進(jìn)行掃描,記錄吸收峰。

1.5 aASP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞毒性作用的測(cè)定

制備脾臟淋巴細(xì)胞。使用頸椎脫臼法處死小鼠,無(wú)菌分離脾臟后進(jìn)行研磨、勻漿,加入紅細(xì)胞裂解液,去除紅細(xì)胞后收集脾臟淋巴細(xì)胞,PBS洗滌3～5次,用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞含量至1×106mL-1,接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后培養(yǎng)[14]。將1 000 μg·mL-1aASP用細(xì)胞維持液倍比稀釋成7個(gè)濃度梯度,每孔加入100 μL,每個(gè)濃度重復(fù)4孔。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(僅加細(xì)胞培養(yǎng)液)。培養(yǎng)45 h后用MTT法經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)吸光值(A570)。選擇A570值不小于細(xì)胞對(duì)照組的最大濃度作為該多糖的最大安全濃度。

1.6 aASP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖影響的測(cè)定

按照1.5節(jié)方法制備小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液,將混合均勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入96孔板,每孔80 μL,然后分別加入20 μL多糖,多糖濃度分別為500、125 和31.25 μg·mL-1,3種濃度梯度多糖協(xié)同LPS組(LPS終質(zhì)量濃度5 μg·mL-1)刺激B淋巴細(xì)胞增殖,3種濃度梯度多糖協(xié)同PHA組(PHA終質(zhì)量濃度5 μg·mL-1)刺激T淋巴細(xì)胞增殖,RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)44 h后,每孔加入30 μL MTT,4 h后棄上清液,每孔加入100 μL DMSO,振蕩培養(yǎng)5 min,檢測(cè)A570值,作為細(xì)胞增殖指標(biāo)。

1.7 aASP對(duì)小鼠脾臟T細(xì)胞免疫分型影響的測(cè)定

淋巴細(xì)胞制備方法同1.5節(jié),用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞含量至1×106mL-1,于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),分別加入500、125和31.25 μg·mL-1aASP溶液100 μL,同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(LPS)組和空白對(duì)照組(RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液),于細(xì)胞培養(yǎng)箱中以適當(dāng)?shù)臈l件培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞并以PBS洗滌2次,再用PE-Cyanine5-CD3e、FITC-CD4和PE-CD8a熒光抗體標(biāo)記淋巴細(xì)胞,孵育30 min后用PBS洗滌2次,流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞分化情況。

1.8 aASP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞因子分泌影響的檢測(cè)

收集1.5節(jié)中藥物處理48 h的細(xì)胞上清液,2 000 r·min-1室溫離心5 min,去除沉淀,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定A570值,檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

圖1 駱駝刺酸性多糖(aASP)的DEAE-52(A)和Sephadex G-100(B)洗脫曲線Fig.1 Elution curves of DEAE-52(A)and Sephadex G-100(B)for acidic Alhagi sparsifolia Shap polysaccharide(aASP)

2 結(jié)果與分析

2.1 aASP分離純化后的含量

圖1-A為多糖經(jīng)過(guò)凝膠纖維DEAE-52分離后的洗脫曲線,多糖分別經(jīng)去離子水和0.1及0.2 mol·L-1的NaCl溶液洗滌后分別出現(xiàn)3個(gè)收集峰,其中多糖經(jīng)去離子水洗脫后在第9～21管出現(xiàn)的收集峰面積最大,為主要收集峰。為了得到糖含量更高的純多糖,對(duì)DEAE-52分離后的第1個(gè)吸收峰用Sephadex G-100柱進(jìn)一步純化,如圖1-B洗脫曲線所示。aASP的洗脫曲線有2個(gè)峰,其中第1個(gè)峰面積最大、峰值最高且對(duì)稱(chēng)性較好,可知純化后的多糖aASP為均質(zhì)多糖。采用苯酚硫酸法測(cè)定純化后aASP的糖含量,得到回歸方程y=17.71x-0.005 9(R2=0.999 5);用硫酸-咔唑法測(cè)定樣品中糖醛酸的含量,得到線性回歸方程y=11.515x-0.005 9(R2=0.999 8);采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定,得到線性回歸方程y=0.008 2x-0.002 39(R2=0.999)。駱駝刺多糖提取物糖含量為(81.8±1.2)%,糖醛酸含量為(17.34±0.75)%,蛋白含量為(0.54±0.08)%,可初步判斷為酸性多糖。

2.2 aASP的紅外光譜

如圖2所示:aASP在3 430.29 cm-1處有較寬的伸縮峰,在2 936.76 cm-1處有中強(qiáng)吸收峰,以上2個(gè)吸收峰為典型糖類(lèi)特有的峰。在1 746.88 cm-1處特征峰有個(gè)酯基,在1 617.69 cm-1處的強(qiáng)吸收峰為羧基和羰基不對(duì)稱(chēng)伸縮震動(dòng)吸收峰。在1 640～1 610 cm-1處有特征峰表明有糖醛酸,在1 420.14 cm-1測(cè)得羥基的吸收峰,1 300～1 000 cm-1的吸收峰為多糖C—O和C—C鍵的伸縮震動(dòng)吸收峰。結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步確定為酸性多糖。

2.3 aASP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的最大安全濃度

如圖3所示:aASP質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1時(shí)A570值與細(xì)胞對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),而aASP濃度在500～125 μg·mL-1時(shí)A570值顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果表明,aASP在1 000 μg·mL-1時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性作用,表現(xiàn)出良好的安全性,而aASP濃度在500～125 μg·mL-1時(shí)對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞增殖作用。故將1 000 μg·mL-1作為aASP的最大安全濃度。

圖2 aASP的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of aASP

圖3 aASP對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞安全濃度的檢測(cè)Fig.3 Safe concentration of aASP in spleen lymphocytes不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),下同。The different letters mean significant difference at 0.05 level. The same below.

圖4 aASP單獨(dú)(A)和aASP協(xié)同LPS(B)或PHA(C)刺激淋巴細(xì)胞增殖的變化Fig.4 Changes of lymphocyte proliferation stimulated by aASP alone(A)and with LPS(B)or PHA(C)aASPH、aASPM、aASPL表示aASP質(zhì)量濃度分別為500、125、31.25 μg·mL-1 aASPH,aASPM and aASPL mean the mass concentration of aASP is 500,125 and 31.25 μg·mL-1,respectively;Con:空白對(duì)照Control;LPS:5 μg·mL-1 LPS;PHA:5 μg·mL-1 PHA μg·mL-1. 下同。The same below.

2.4 aASP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

為了檢測(cè)aASP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖效果,采用MTT法檢測(cè)aASP刺激脾淋巴細(xì)胞后的A570值。如圖4-A 所示:aASP 500 μg·mL-1的A570值顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),而125和31.25 μg·mL-1aASP的A570值和空白對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(P>0.05),表明500 μg·mL-1aASP能顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖。已知LPS能夠誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖,而PHA能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖,因此將多糖和LPS或PHA混合作用于脾淋巴細(xì)胞可檢測(cè)多糖協(xié)同LPS或PHA對(duì)B淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞增殖的作用[15]。如圖4-B、C所示:不同濃度aASP協(xié)同LPS或PHA產(chǎn)生的細(xì)胞增殖效果均顯著高于單獨(dú)的LPS組或PHA組(P<0.05),表明aASP不但能夠單獨(dú)刺激脾臟淋巴細(xì)胞的增殖,而且還能協(xié)同PHA對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖效果,協(xié)同LPS對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖效果。

2.5 aASP對(duì)小鼠脾T 淋巴細(xì)胞分型的影響

已知LPS能夠同時(shí)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8a+的分化,因此LPS常作為陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)藥物對(duì)CD4+和CD8a+T細(xì)胞的分化效果[15]。如圖5-D、E所示:aASP能夠促進(jìn)CD4+和CD8a+T細(xì)胞的分化,分化水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。高濃度aASP刺激CD4+T細(xì)胞分化的水平與LPS組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05);高、中濃度的aASP刺激CD8a+T細(xì)胞分化的水平與LPS組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05),以上結(jié)果表明高濃度aASP能夠顯著促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞的分化;如圖5 F所示:高、中濃度aASP刺激CD4+/CD8a+T細(xì)胞的比值和LPS組相比無(wú)顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明aASP具有良好的免疫刺激效果,免疫細(xì)胞偏向CD4+T細(xì)胞分化。

圖5 CD4+、CD8a+和CD4+/CD8a+ T細(xì)胞的流式圖(A、B、C)和細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖(D、E、F)Fig.5 Flow cytometry(A,B,C)and T cell statistics(D,E,F)of CD4+,CD8a+ and CD4+/CD8a+

2.6 aASP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞因子分泌的影響

如圖6所示:高、中濃度的aASP均能促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的分泌,分泌水平均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),TNF-α和IL-6的分泌水平和LPS組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05),IFN-γ 和IL-4的分泌水平顯著高于LPS組(P<0.05),結(jié)果說(shuō)明aASP可誘導(dǎo)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th1(helper T lymphocyte 1)及 Th2(helper T lymphocyte 2)混合型免疫應(yīng)答。

圖6 各試驗(yàn)組對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子分泌水平的影響Fig.6 Effects of experimental groups on serum cytokine secretion levels of mice

3 討論

酸性多糖中通常含有糖醛酸、硫酸根等官能團(tuán),可通過(guò)顯色法及紅外光譜法進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)硫酸-咔唑法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)aASP駱駝刺多糖中含有大量糖醛酸,為酸性多糖;紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)aASP在1 746.53 cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰,進(jìn)一步驗(yàn)證aASP為酸性多糖,含有糖醛酸,但不含硫酸根。MTT法常用于檢測(cè)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和細(xì)胞密度,且重復(fù)效果較好[16]。本試驗(yàn)用MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的最大安全濃度,結(jié)果顯示aASP在1 000 μg·mL-1無(wú)細(xì)胞毒性作用,因此判斷1 000 μg·mL-1為aASP的最大安全濃度,且具有良好的安全性。aASP協(xié)同PHA和LPS刺激脾淋巴細(xì)胞結(jié)果顯示,aASP不僅能夠單獨(dú)刺激脾臟淋巴細(xì)胞的增殖,還能協(xié)同PHA對(duì)小鼠脾T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖效果,也協(xié)同LPS對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖效果。

T淋巴細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞應(yīng)答,是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞[17-18]。在免疫學(xué)研究中,流式細(xì)胞術(shù)用來(lái)計(jì)數(shù)特定的細(xì)胞亞群,T淋巴細(xì)胞按表型不同可分為CD4+和CD8+兩大亞群,CD4+T細(xì)胞可表現(xiàn)出多種功能,主要為T(mén)h1亞群和Th2亞群,CD4+T細(xì)胞可協(xié)助B細(xì)胞進(jìn)行分化,參與細(xì)胞免疫應(yīng)答,而CD8+T細(xì)胞則對(duì)病原體具有殺傷和抑制作用。Th1和Th2細(xì)胞亞型之間的動(dòng)態(tài)平衡在維持生物體的正常免疫功能中起重要作用[19-20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,aASP能夠促進(jìn)CD4+和CD8a+T細(xì)胞的分化,aASP刺激T細(xì)胞分化結(jié)果顯示,高、中濃度aASP刺激T細(xì)胞CD4+/CD8a+比值和LPS組相比無(wú)顯著性差異,可以進(jìn)一步確定aASP具有良好的免疫刺激效果,免疫細(xì)胞偏向CD4+T細(xì)胞分化。

細(xì)胞因子是一類(lèi)能在細(xì)胞間傳遞信息且有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的蛋白質(zhì)或小分子多肽,是免疫反應(yīng)的介質(zhì),是CD4+T細(xì)胞功能激活和增殖的重要標(biāo)志[21-22]。Th1型細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-12等細(xì)胞因子,Th2型細(xì)胞分泌IL-6、IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子[23-25]。Thl型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,具有介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和促進(jìn)CD8a+T細(xì)胞分化成熟的功能;Th2型分泌的細(xì)胞因子,具有介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明,高、中濃度的aASP可顯著促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-4的分泌,IFN-γ和 IL-4 的分泌水平顯著高于LPS組,表明aASP能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th1和Th2混合型免疫應(yīng)答。

綜上,aASP可以促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th1及Th2混合型免疫反應(yīng),促使T細(xì)胞偏向CD4+細(xì)胞分化。說(shuō)明aASP對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)較強(qiáng),具有一定開(kāi)發(fā)價(jià)值。