王振偉，孫亦粉，李海倫，李新新△

（1.中國人民解放軍海軍特色醫(yī)學中心，上海 200050；2.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256603）

呋鋅軟膏是濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院自主研發(fā)制劑，具有消炎、護膚、吸濕作用，用于膿皰瘡、嚴重急性皮炎及感染性濕疹等。呋鋅軟膏的主藥為呋喃西林和氧化鋅。呋喃西林能干擾細菌的糖代謝過程和氧化酶系統(tǒng)而發(fā)揮抑菌或殺菌作用，主要干擾細菌糖代謝的早期階段，導致細菌代謝紊亂而死亡；其抗菌譜較廣，對多種革蘭陽性和陰性菌有抗菌作用，對厭氧菌也有作用。氧化鋅對皮膚具有收斂、干燥的功能，用于慢性皮炎，也可用于淺表創(chuàng)傷、燒傷及褥瘡的輔助治療。呋喃西林與氧化鋅聯(lián)用具有協(xié)同增強作用。由于該制劑有一定粘稠度，且含有較強的抑菌成分，為保證微生物限度檢查法的準確性，根據(jù)《中國藥典（2020版）》四部規(guī)定，參照通則1105、1106、1107的要求[1]，摸索實驗方法，建立呋鋅軟膏微生物限度檢查的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器TD2102型電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）；HH-8型電熱恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；DHG-90型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海索譜儀器有限公司）；YLA-2000-300型恒溫培養(yǎng)箱（山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司）；HRSP-70H生化培養(yǎng)箱（青島海爾特種電冰柜有限公司）；HTY-100型無菌檢查儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；SA-1200型凈化工作臺（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；BSC-ⅡA2型生物學安全臺（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；LMQ.C立式壓力蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.2 試藥呋鋅軟膏（批號：20190707、20190812、20190910，規(guī)格：50g，濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院自制）。

1.3 培養(yǎng)基及試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：1909114）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：1904141）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：18112767）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號：18102544）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：19040261）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（批號：18122761）、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：1812056）均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；聚山梨酯80（批號：20181025）、氯化鈉（批號：20190121）、司盤80（批號：20180520）、單硬脂酸甘油酯（批號：20190612）、十四烷酸異丙酯（批號：20190909）均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC(B)26003〕、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC(B)10104〕、枯草芽孢桿菌（Ba‐cillus subtilis）〔CMCC(B)63501〕、白色念珠菌（Can‐dida albicans）〔CMCC(F)98001〕、黑曲霉（Aspergil‐lus niger）〔CMCC(F)98003〕，以上菌株均為第3代，均購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備（1）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌：分別取菌種接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)24h。取新鮮培養(yǎng)物1mL，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成每1mL含菌數(shù)為<100cfu的菌懸液。（2）白色念珠菌：取菌種接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)72h。取新鮮培養(yǎng)物1mL，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成每1mL含菌數(shù)為<100cfu的菌懸液。（3）黑曲霉：取菌種接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20℃培養(yǎng)5天，加入5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，并吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成每1mL含孢子數(shù)

2.2 供試液及稀釋液的制備

2.2.1 A法 取供試品5g，加至含溶化的司盤80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的無菌混合物（溶化，溫度不超過45℃）的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，分次慢慢加入45℃的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20供試液。取上述供試液20mL，加入45℃的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，作為1:100供試液。取熔化的（溫度不超過45℃）司盤80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g至燒杯中，用無菌玻棒攪拌均勻，加45℃pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，作為稀釋液。

2.2.2 B法 取供試品10g，加至含20mL無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的三角瓶中，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45℃的含8%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖10min，萃取，待油水明顯分層，取其水層作為1:10供試液。取上述供試液10mL，加入45℃的含8%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，作為1:100供試液。取20mL無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠至三角瓶中，加45℃含8%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖10min，萃取，待油水明顯分層，取水層作為稀釋液。

2.3 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.3.1 驗證方法 因呋鋅軟膏具有明顯的抑菌作用，因此采用培養(yǎng)基稀釋法與薄膜過濾法進行驗證試驗，每種方法分4組，取3批樣品進行獨立的平行試驗，每個實驗做2次，按供試液的制備方法分別計算供試品組和對照組試驗的菌回收率。

2.3.2 試驗組（1）培養(yǎng)基稀釋法：①取“2.2.1”中的1:100供試液1mL和“2.1”中的菌液1mL，按規(guī)定條件操作培養(yǎng)，以測定供試品的菌落數(shù)，計算各試驗菌株的回收率。②取“2.2.2”中的1:100供試液1mL和“2.1”中的菌液1mL，按規(guī)定條件操作培養(yǎng)，測定其菌落數(shù)，計算各試驗菌株的回收率。（2）薄膜過濾法：①取“2.2.1”中的1:20供試液1mL過濾，用45℃的含8%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500mL分5次沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中加入“2.1”中的菌液1mL，沖洗濾膜，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，按規(guī)定條件操作培養(yǎng)，測定其菌落數(shù)，計算各試驗菌株的回收率。②取“2.2.2”中的1:10供試液1mL過濾，用45℃的含8%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500mL分5次沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中加入“2.1”中的菌液1mL，沖洗濾膜，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，按規(guī)定條件操作培養(yǎng)，測定其菌落數(shù)，計算各試驗菌株的回收率。

2.3.3 菌液組 取“2.1”中的菌液1mL，按規(guī)定條件操作培養(yǎng)，測定菌液中的菌落數(shù)，計算各試驗菌株的回收率。

2.3.4 供試品對照組（1）培養(yǎng)基稀釋法：用稀釋液替代菌液，其余操作參照“2.3.2”培養(yǎng)基稀釋法。（2）薄膜過濾法：用稀釋液替代菌液，其余操作參照“2.3.2”薄膜過濾法。

2.3.5 稀釋劑對照組（1）培養(yǎng)基稀釋法：取相應(yīng)量的稀釋液替代供試液，其余操作參照“2.3.2”培養(yǎng)基稀釋法。（2）薄膜過濾法：取相應(yīng)量的稀釋液替代供試液，其余操作參照“2.3.2”薄膜過濾法。

2.3.6 計算公式及結(jié)果判斷

2.3.6.1 計算公式 稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率（%）=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%；試驗組的菌數(shù)回收率（%）=（試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組的平均菌落數(shù)）÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

2.3.6.2 結(jié)果判斷 根據(jù)《中國藥典（2020版）》四部通則1105微生物計數(shù)法的要求，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5~2范圍內(nèi)?！吨袊幤窓z驗標準操作規(guī)范（2010版）》規(guī)定，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率應(yīng)均不低于70%，若3次獨立平行試驗中試驗組的菌數(shù)回收率均不低于70%，則說明可照該供試品溶液制備方法和計數(shù)方法測定該供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗中試驗組的菌數(shù)回收率低于70%，則說明所采用的方法不可行，應(yīng)改用其他方法消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。由表1、表2可知，采用培養(yǎng)基稀釋法時，A、B兩種方法制備的供試液，需氧菌總數(shù)計數(shù)時金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌的回收率均低于50%，表明該方法不適合呋鋅軟膏的需氧菌總數(shù)計數(shù)；霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)時2種菌的回收率均大于50%，表明該方法可用于呋鋅軟膏的霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)。采用薄膜過濾法檢查需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)時，經(jīng)由試驗發(fā)現(xiàn)A法制備的供試液無法透過薄膜，薄膜過濾法無法完成。由B方法制備供試液，采用薄膜過濾法適合呋鋅軟膏的需氧菌總數(shù)計數(shù)。

表1 需氧菌總數(shù)適用性驗證結(jié)果

表2 霉菌及酵母菌總數(shù)適用性驗證結(jié)果

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 菌種選擇呋鋅軟膏為局部給藥制劑，根據(jù)《中國藥典（2020版）》四部通則微生物限度檢查法中的有關(guān)控制菌檢查方法，該制劑不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌。

2.4.2 驗證方法（1）供試品組：取B法制備1:10供試液10mL，置0.9%無菌氯化鈉溶液90mL中，薄膜過濾，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100mL，沖洗5次，取濾膜，加至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL中，32℃培養(yǎng)24h。（2）陰性對照組：取B法制備稀釋液10mL，置0.9%無菌氯化鈉溶液90mL中，薄膜過濾，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100mL，沖洗5次，取濾膜，加至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL中，32℃培養(yǎng)24h。（3）試驗組：取B法制備1:10供試液10mL，置0.9%無菌氯化鈉溶液90mL中，薄膜過濾，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100mL，沖洗5次，在最后1次沖洗液中分別加入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，取濾膜，加至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL中，32℃培養(yǎng)24h。（4）陽性對照組：取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL，置0.9%無菌氯化鈉溶液90mL中，薄膜過濾，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次100mL，沖洗5

次，在最后1次沖洗液中分別加入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，取濾膜，加至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL中，32℃培養(yǎng)24h。（5）金黃色葡萄球菌檢查：分別取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，32℃培養(yǎng)72h。（6）銅綠假單胞菌檢查：分別取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，32℃培養(yǎng)72h。

2.4.3 驗證結(jié)果 由表3可知，試驗組和陽性對照組正常檢出，陰性對照組和供試品組未檢出，符合《中國藥典（2020版）》四部通則控制菌檢查的要求。按照B法制備供試液，采用薄膜過濾法（沖洗量500mL），增菌培養(yǎng)選擇100mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，可作為呋鋅軟膏金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的控制菌檢查。

表3 控制菌檢查適用方法驗證結(jié)果

3 討論

呋鋅軟膏的輔料主要為羊毛脂和凡士林，采用乳化法制備供試液時，在薄膜過濾時速度很慢甚至堵塞薄膜，無法過濾，直接影響微生物限度檢驗過程及結(jié)果[2]；當用十四烷酸異丙酯進行萃取后的供試液進行薄膜過濾，并在水相沖洗液中加入具有較強表面活性的聚山梨酯80[3]，能很好地通過薄膜，達到檢驗?zāi)康摹?/p>

呋鋅軟膏處方中含有呋喃西林等抑菌成分，具有較強的抑菌活性。由試驗可知，該藥對5種試驗菌株具有不同程度的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用較強，對黑曲霉和白色念珠菌的抑制作用較弱。采用培養(yǎng)基稀釋法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)適用性試驗時，發(fā)現(xiàn)本品對金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌具有較強的抑制能力，其回收率均<50%，故另用薄膜過濾法消除供試品的抑菌活性。經(jīng)過前期摸索試驗，證明單獨使用薄膜過濾法亦不能達到《中國藥典（2020版）》四部要求。當沖洗液中加入聚山梨酯80能有效消除供試品的抑菌活性。聚山梨酯80可同時作為本供試品的乳化劑和中和劑，簡化檢查方法，提高效率[4]。但聚山梨酯80濃度過高時，也容易堵塞濾膜。對加入中和劑的量及沖洗量進行進一步考察，以消除其抗菌活性為目的，最終篩選出最適合的方法[5]。

總而言之，呋鋅軟膏的微生物限度檢查方法最終選擇B法制備供試液。需氧菌總數(shù)計數(shù)采用薄膜過濾法加中和劑，取1:10稀釋級供試液10mL進行沖洗，沖洗液為45℃的含8%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗量為500mL。霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，取1:100稀釋級供試液1mL進行培養(yǎng)?？刂凭鷻z查：采用薄膜過濾法，取1:10稀釋級供試液10mL進行沖洗，沖洗量為500mL，接種至100mL酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢查方法檢查。本方法科學準確，可為具有類似抗菌活性軟膏劑的微生物限度檢查方法的設(shè)計提供參考。