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        表面活性劑對鞣花酸的增溶及其抗氧化性能研究

        2022-11-21 08:27:20伍佑輝蔣新元倪丹賀靖雁唐玉蓮龐亞輝段泉
        應(yīng)用化工 2022年10期
        關(guān)鍵詞:花酸水溶液活性劑

        伍佑輝,蔣新元,倪丹,賀靖雁,唐玉蓮,龐亞輝,段泉

        (1.中南林業(yè)科技大學(xué) 理學(xué)院,湖南 長沙 410004;2.中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410004;3.湖南省木本生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410004)

        鞣花酸是一種植物多酚,幾乎不溶于水及醇類溶劑,而溶于吡啶、二甲基亞砜和三乙醇胺等[1-2]。既能抗炎、抗菌、抗病毒,又可以抗氧化、美白、抗衰老[3-4],在化妝品中有很好的應(yīng)用前景。它已列入《國際化妝品原料標(biāo)準(zhǔn)目錄》(INCI),也被列入國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《國際化妝品原料標(biāo)準(zhǔn)中文名稱目錄》中[5]。研究[6]表明化妝品里所添加的鞣花酸含量極低,很難達(dá)到標(biāo)注所說的美白功能及抗衰老能力。

        本實驗研究了非離子型表面活性劑對鞣花酸的增溶作用,及鞣花酸在表面活性劑增溶體系中對自由基的清除能力,為擴大鞣花酸在化妝品[7]、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)支持。

        1 實驗部分

        1.1 試劑與儀器

        鞣花酸(w=98%)、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、DPPH、ABTS均為分析純;維生素C(簡稱Vc)。

        TM-1810型紫外可見分光光度計;85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器;BHS-1數(shù)顯恒溫水浴鍋;1510酶標(biāo)儀;96孔板。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 鞣花酸在非離子表面活性劑溶液中的紫外光譜測定 在150 mL錐形瓶中分別加入30 mg的鞣花酸,再分別加入0.10 g/L的非離子表面活性劑Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80溶液各100 mL,置于磁力攪拌器上以500 r/min攪拌3 h,然后在35 ℃的恒溫水浴鍋中密封靜置24 h后定容搖勻,制備鞣花酸表面活性劑增溶體系。以相同濃度表面活性劑溶液作為參比,將制備鞣花酸表面活性劑增溶體系稀釋10倍后用紫外分光光度計測定其紫外吸收光譜。

        1.2.2 表面活性劑溶液濃度對鞣花酸增溶的影響 選取增溶效果好的表面活性劑進行濃度對鞣花酸增溶的影響研究。在150 mL錐形瓶中各加入30 mg 的鞣花酸,再加入一定體積配制好的表面活性劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別配制表面活性劑溶液濃度在0.001~50.00 g/L范圍的鞣花酸-表面活性劑增溶體系,然后置于磁力攪拌器上以500 r/min攪拌3 h,再在35 ℃ 的恒溫條件下密封靜置24 h后定容搖勻。以相應(yīng)濃度表面活性劑溶液作為參比,鞣花酸表面活性劑增溶體系稀釋10倍后在397 nm波長下用紫外分光光度計測定其吸光度,重復(fù)3次,取平均值。根據(jù)鞣花酸表面活性劑增溶體系標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算鞣花酸在表面活性劑溶液中的增溶濃度。

        1.2.3 溫度對表面活性劑增溶鞣花酸的影響 選取濃度為10.00 g/L的表面活性劑溶液研究溫度對表面活性劑增溶鞣花酸的影響,其余操作方法同上,選擇溫度范圍5~45 ℃進行實驗研究,重復(fù)3次,取平均值。

        1.2.4 鞣花酸表面活性劑增溶體系穩(wěn)定性的測定 在10.00 g/L的表面活性劑溶液中加入30 mg的鞣花酸,制備鞣花酸增溶體系,操作方法同上,在35 ℃ 恒溫條件下存放,測定增溶體系中鞣花酸吸光度隨時間的變化,重復(fù)3次,取平均值。

        1.2.5 鞣花酸表面活性劑增溶體系對ABTS·清除能力的測定 按照文獻[8]的方法,加以改進。ABTS溶液按照文獻[9]配制:精密稱取0.038 4 g的ABTS溶解于10 mL蒸餾水中,精密稱取0.006 7 g的過硫酸鉀溶解于10 mL蒸餾水中,避光冷藏放置16~24 h,得到ABTS母液。實驗時用蒸餾水稀釋,使其吸光度(λ=734 nm)在(0.7±0.1) 。

        鞣花酸增溶體系的配制:以10.00 g/L的Tween-20溶液配制鞣花酸濃度為50 mg/L的Tween-20增溶體系。然后用相同濃度的Tween-20溶液為稀釋液,配制鞣花酸濃度在0.10~8.00 mg/L范圍的系列鞣花酸Tween-20增溶體系。

        對照品Vc溶液的配制:配制濃度在0.10~8.00 mg/L范圍的系列Vc溶液,配制好的溶液需避光保存。

        ABTS·清除率的測定:在96孔板中按照文獻[10]取液,混合液在室溫避光反應(yīng)30 min后,用酶標(biāo)儀在734 nm下測吸光度值,計算抑制率。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)孔重復(fù)3次,取平均值。

        ABTS·清除率(S,%)計算公式如下:

        S=[1-(A1-A2)/A0]×100%

        (1)

        式中A0——空白組(ABTS溶液+溶劑)的吸光度值;A1——樣品組(ABTS溶液+樣品)的吸光度值;A2——對照組(水+樣品)的吸光值。

        1.2.6 鞣花酸表面活性劑增溶體系對DPPH·清除能力的測定 按照文獻[8]的方法,加以改進。DPPH溶液按照文獻[9]配制:稱取5 mg DPPH(精準(zhǔn)至0.000 1 g)溶解于100 mL無水乙醇中,作為儲備液。實驗時用無水乙醇稀釋,使其吸光度(λ=517 nm)在(0.7±0.1)。

        鞣花酸增溶體系的配制:同1.2.5節(jié),稀釋配制鞣花酸濃度在0.20~10.00 mg/L范圍的系列鞣花酸Tween-20增溶體系。

        對照品Vc溶液的配制:配制濃度在0.20~10.00 mg/L范圍的Vc溶液,配制好的溶液需避光保存。

        DPPH·清除率的測定:在96孔板中按文獻[10]取液,混合液在室溫避光反應(yīng)30 min后,用酶標(biāo)儀在517 nm下測吸光度值,計算抑制率。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)孔重復(fù)3次,取平均值。

        DPPH·清除率(S,%)計算公式如下:

        S=[1-(A1-A2)/A0]×100%

        (2)

        式中A0——空白組(DPPH溶液+水)的吸光度值;A1——樣品組(DPPH溶液+樣品)的吸光度值;A2——對照組(無水乙醇+樣品)的吸光值。

        1.2.7 粒徑分布及Zeta電位測定 在室溫下,將鞣花酸Tween-20增溶體系溶液注入測試項目對應(yīng)的比色容器中,在90°散射條件下對鞣花酸Tween-20增溶體系溶液的粒徑及電位進行測試,重復(fù)3次取平均值。

        1.2.8 透射電鏡(TEM)分析 用滴管取少量鞣花酸Tween-20增溶體系溶液滴加置200目銅網(wǎng)上,待滴加樣品的銅網(wǎng)自然風(fēng)干后,在50 ℃烘箱中干燥20 min除去多余的水分,然后置于TEM下尋找并分析鞣花酸Tween-20增溶體系溶液中的自聚體形態(tài)。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 非離子表面活性劑對鞣花酸的增溶效果

        2.1.1 鞣花酸表面活性劑增溶體系中的紫外吸收光譜特征 非離子表面活性劑吐溫(Tween)系列溶液中鞣花酸的紫外吸收光譜見圖1。

        圖1 Tween系列溶液中鞣花酸的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra of ellagic acid in Tween series solutions

        由圖1可知,Tween系列溶液中鞣花酸在255 nm 處均有一個強吸收峰,在397 nm處有一個弱吸收峰,與鞣花酸在水溶液中的紫外吸收光譜保持一致[1],說明鞣花酸在Tween系列溶液進行增溶后結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變,鞣花酸在Tween系列溶液保持了鞣花酸原有的性質(zhì)和功效性。其中Tween-60的增溶效果明顯較低,而Tween-20、Tween-40、Tween-80溶液對鞣花酸的增溶效果相差不大,其中又以Tween-20的增溶效果最好。

        2.1.2 鞣花酸在Tween-20溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 精確稱取12.5 mg鞣花酸,用10.00 g/L的Tween-20溶液進行溶解、攪拌、再使用超聲處理使其完全分散溶解后定容于250 mL容量瓶中,分別稀釋制備成鞣花酸濃度為1~25 mg/L系列鞣花酸Tween-20增溶體系,以相應(yīng)濃度的Tween-20溶液為參比,于397 nm處測定鞣花酸的吸光度,以增溶體系的吸光度(A)對鞣花酸濃度(C,mg/L)作線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.045 65C-0.050 16(r=0.999 4),見圖2,表明在1~25 mg/L內(nèi),增溶體系中鞣花酸的吸光度與鞣花酸的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

        圖2 鞣花酸Tween-20增溶體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ellagic acid Tween-20 solubilizing system

        2.1.3 Tween-20溶液濃度對鞣花酸增溶效果的影響 不同濃度的Tween-20溶液對鞣花酸的增溶效果見圖3。

        圖3 Tween-20溶液濃度對鞣花酸的增溶效果的影響Fig.3 Solubilization effect of Tween-20 solution concentrations on ellagic acid

        由圖3可知,當(dāng)Tween-20溶液濃度較低時,鞣花酸的增溶隨著Tween-20溶液濃度的增加而顯著增加,當(dāng)Tween-20溶液濃度達(dá)到1.00 g/L的時候,鞣花酸的增溶增長則變得比較緩慢,當(dāng)Tween-20溶液濃度達(dá)到10.00 g/L以上的時候,鞣花酸的增溶不再隨著Tween-20溶液濃度的增加而增加,甚至出現(xiàn)下降的趨勢,可能是由于Tween-20溶液濃度較高時,溶液粘度較大,同時Tween-20分子間更易形成氫鍵,從而影響了鞣花酸分子在Tween-20分子聚氧乙烯鏈上的增溶。10.00 g/L的Tween-20溶液中鞣花酸的濃度為238.59 mg/L,相應(yīng)溫度下鞣花酸飽和水溶液的濃度為10.12 mg/L,約為水中溶解的鞣花酸質(zhì)量濃度的24倍,因此,選取10.00 g/L的Tween-20溶液作為鞣花酸的增溶液來進行后續(xù)實驗。

        2.1.4 溫度對Tween-20溶液增溶鞣花酸的影響 不同溫度下, Tween-20溶液對鞣花酸的增溶情況見圖4。

        圖4 溫度對鞣花酸在Tween-20溶液中增溶的影響Fig.4 Effect of temperature on solubilization of ellagic acid in Tween-20 solution

        由圖4可知,在溫度較低時隨溫度升高,鞣花酸在Tween-20溶液增溶效果逐漸提高,但增長不顯著,當(dāng)溫度升高到35 ℃后,鞣花酸的增溶量變化趨緩,說明溫度變化對鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶效果影響不大。在本論文實驗中選擇35 ℃進行實驗。

        2.1.5 鞣花酸Tween-20增溶體系的穩(wěn)定性 由圖5可知,鞣花酸Tween-20增溶體系在前8 d的吸光度數(shù)據(jù)較穩(wěn)定,但從第8 d開始,吸光度出現(xiàn)驟降,第12 d以后,吸光度開始成規(guī)律性緩慢下降。綜上,鞣花酸Tween-20增溶體系在開始配制好的一段時間內(nèi)有較好的穩(wěn)定性,但隨時間延長,穩(wěn)定性有所下降。

        圖5 鞣花酸Tween-20增溶體系穩(wěn)定性隨時間的變化Fig.5 Stability of ellagic acid Tween-20 solubilized system with time

        2.2 鞣花酸Tween-20增溶體系的抗氧化作用

        目前,常用DPPH·、ABTS·、超氧陰離子自由基、羥基自由基等清除實驗及脂質(zhì)過氧化抑制實驗和總抗氧化能力的測定等方法來測定抗氧化性物質(zhì)的體外活性[11]。由于在超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除實驗中要用到FeSO4,而FeSO4易與鞣花酸生成藍(lán)色絡(luò)合物,從而影響測定結(jié)果,故實驗室常用DPPH·清除[9]、ABTS·清除[10]分析鞣花酸的抗氧化作用[12-13],本實驗使用酶標(biāo)儀-微孔板法測定鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·、ABTS·的清除能力,并以Vc水溶液為對比。

        2.2.1 鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·清除作用 由圖6可知,隨著溶液濃度的增加,鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對ABTS·的清除率增加,在濃度較低的情況下,鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·的清除率明顯大于Vc水溶液對ABTS·的清除率,鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·的清除能力的IC50為0.31 mg/L,Vc水溶液的IC50為3.32 mg/L,說明鞣花酸作為一種很好的抗氧化活性成分經(jīng)過表面活性劑增溶后其對ABTS·的清除能力不會受到影響,且增溶體系對ABTS·的清除能力優(yōu)于Vc。

        圖6 鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·的清除作用Fig.6 Scavenging effect of ellagic acid- Tween-20 solubilizing system on ABTS free radical

        2.2.2 鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除作用 由圖7可知,隨著鞣花酸和Vc濃度的增加,鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對DPPH·的清除率增加,在濃度較低的情況下,鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除率明顯大于Vc水溶液對DPPH·的清除率,在濃度較高時,二者清除率相近,鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除能力的IC50為0.92 mg/L,Vc水溶液的IC50為2.40 mg/L。說明鞣花酸作為一種很好的抗氧化活性成分經(jīng)過表面活性劑增溶后其對DPPH·的清除能力不會受到影響,且增溶體系清除DPPH·的能力優(yōu)于Vc。

        圖7 鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of ellagic acid- Tween-20 solubilizing system on DPPH free radical

        2.3 鞣花酸增溶體系的表征分析

        2.3.1 粒徑及Zeta電位分析 鞣花酸Tween-20增溶體系中粒子的大小及其分布指數(shù)(PDI)見圖8。

        圖8 鞣花酸Tween-20增溶體系的粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of Tween-20 solubilized system

        由圖8可知,該增溶體系的平均粒徑為(272.5±3.62) nm,PDI為0.230±0.010,Zeta-電位為(-41.57±1.88) mV,其粒徑呈正態(tài)分布,但也存在微量粒徑低于100 nm和高于3 000 nm以上的粒子,同時其電位的絕對值較大,說明增溶體系的穩(wěn)定性較佳。

        2.3.2 透射電鏡形貌觀察 通過粒徑分析,對鞣花酸增溶體系的粒徑大小有了大概的推論。為了更加直觀的判斷其微觀結(jié)構(gòu),采用TEM對鞣花酸增溶體系中的形態(tài)做更為具體的展示,結(jié)果見圖9。

        由圖9可知,鞣花酸增溶體系中不僅發(fā)現(xiàn)了直徑約為40~100 nm(圖9A)、100~1 000 nm(圖9B)的聚集體,也有直徑約為3 000~6 500 nm的大聚集體(圖9C),該現(xiàn)象與粒徑分布測試的結(jié)果一致。

        圖9 鞣花酸Tween-20增溶體系透射電鏡形貌觀察圖Fig.9 TEM morphology of ellagic acid Tween-20 solubilized system

        3 結(jié)論

        四種Tween系列非離子表面活性劑溶液對鞣花酸的增溶效果表明,4種Tween溶液對鞣花酸都有增溶作用,其中以Tween-20的增溶效果最好,Tween-60的增溶效果最差。

        溫度變化對鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶效果影響不大。在溫度為35 ℃下,Tween-20溶液濃度低于1.00 g/L時,鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大而大幅提高,Tween-20溶液濃度介于1.00~10.00 g/L時,鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大而增長趨緩,當(dāng)Tween-20溶液濃度超過10.00 g/L后,鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大反而逐漸下降。當(dāng)Tween-20溶液濃度為10.00 g/L時,鞣花酸增溶濃度達(dá)到了238.59 mg/L,約為鞣花酸飽和水溶液濃度(10.12 mg/L)的24倍。

        隨著溶液濃度的增加,鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對ABTS·和DPPH·的清除率增加,在濃度較低的情況下,鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·和DPPH·的清除率明顯大于Vc水溶液對ABTS·和DPPH·的清除率,鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·的清除能力的IC50為0.31 mg/L,Vc水溶液的IC50為3.32 mg/L,鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除能力的IC50為0.92 mg/L,Vc水溶液的IC50為2.40 mg/L,說明鞣花酸經(jīng)過表面活性劑增溶后其對ABTS·和DPPH· 的清除能力不會受到影響。

        鞣花酸Tween-20增溶體系的平均粒徑為(272.5±3.62) nm、Zeta-電位為(-41.57±1.88) mV,電位的絕對值較大,表明其穩(wěn)定性較好。

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