吳海燕，孫 霞，張 鋒，姜梅杰，張志軍，曹身云△

1.青島大學(xué)附屬泰安市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東泰安 271000；2.濱州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，山東濱州 256600；3.青島大學(xué)附屬泰安市中心醫(yī)院超聲診療中心，山東泰安 271000；4.青島大學(xué)附屬泰安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東泰安 271000

肺炎克雷伯菌(KP)是我國臨床感染性疾病的第二大致病菌，可引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和組織感染等[1]。近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)不斷出現(xiàn)，且檢出率呈迅速上升趨勢，給人類健康造成嚴(yán)重威脅[2-3]。CRKP通常呈現(xiàn)泛耐藥，僅有多黏菌素和替加環(huán)素敏感性較好，但由于藥物不良反應(yīng)等原因[4]，臨床醫(yī)生常無藥可用。因此，迫切需要一種新的、有效的抗菌藥物來治療CRKP引起的感染。頭孢他啶-阿維巴坦(CZA)是一種新型的β-內(nèi)酰胺合劑，阿維巴坦能夠抑制多種類型的β-內(nèi)酰胺酶，保護(hù)頭孢他啶的殺菌作用[5]，可用于治療CRKP的感染[6]。由于該藥在我國上市時(shí)間較短，對(duì)其耐藥性的研究和報(bào)道較少，為此，本研究就CRKP對(duì)頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥性及碳青霉烯酶表型進(jìn)行分析，以期為臨床治療CRKP感染提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1菌株來源 本研究菌株來源為泰安市中心醫(yī)院2020年6月1日至2021年12月31日從臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)出的100株非重復(fù)CRKP。CRKP定義為對(duì)亞胺培南、美羅培南或厄他培南中任何一種藥物耐藥的肺炎克雷伯菌[7]。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922。

1.2儀器與試劑 Autof ms1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜儀和巧克力平板為鄭州安圖生物有限公司產(chǎn)品。CZA紙片為英國Oxiod公司產(chǎn)品。CZA的E-test條為溫州康泰生物科技有限公司產(chǎn)品，NG-Test CARBA5碳青霉烯酶檢測試劑盒為復(fù)星診斷科技(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定 細(xì)菌的分離培養(yǎng)嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第三版[8]進(jìn)行。取巧克力平板純化培養(yǎng)過夜的單個(gè)菌落采用Autof ms1000全自動(dòng)質(zhì)譜儀進(jìn)行菌株鑒定。

1.3.2CZA藥敏試驗(yàn) CZA藥敏試驗(yàn)首先采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，抑菌圈直徑≥21 mm為敏感，抑菌圈直徑≤20 mm為耐藥。對(duì)于抑菌圈直徑在20～22 mm的細(xì)菌，由于紙片擴(kuò)散法容易出現(xiàn)假敏感或假耐藥，因此用CZA的E-test條進(jìn)行復(fù)核[9]。藥敏試驗(yàn)和結(jié)果判讀參照2021年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100[9]。

1.3.3碳青霉烯酶表型檢測 采用膠體金免疫層析法檢測細(xì)菌所產(chǎn)碳青霉烯酶的表型[10-11]，具體試驗(yàn)方法和結(jié)果判讀參照試劑盒說明書。將檢測卡和提取緩沖液平衡至室溫，滴入5滴(約150 μL)提取緩沖液于無菌EP管中。使用1 μL無菌接種環(huán)取巧克力平板純培養(yǎng)過夜的細(xì)菌，在EP管管壁輕輕研磨，形成均勻的細(xì)菌混懸液。使用一次性移液管，吸取5滴(約100 μL)制備好的細(xì)菌混懸液，加入檢測卡標(biāo)記了“S”的標(biāo)本孔中，室溫放置15 min，讀取結(jié)果。如果只有C線區(qū)域出現(xiàn)一條紅線，說明標(biāo)本中不含檢測試劑盒所檢測的5種碳青霉烯酶或碳青霉烯酶含量低于檢測試劑盒的檢測限，判讀為陰性結(jié)果。如果在C線區(qū)域出現(xiàn)一條紅線，并且在K、O、V、I、N線區(qū)域出現(xiàn)一條或者多條紅線，判讀為陽性結(jié)果。如果C線區(qū)域未出現(xiàn)紅線，說明測試結(jié)果無效。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 CZA耐藥率統(tǒng)計(jì)應(yīng)用WHONET5.6軟件，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)、率表示。參照2021年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1CZA藥敏試驗(yàn)結(jié)果 100株CRKP中對(duì)CZA耐藥24株，敏感76株，CZA的耐藥率為24%(24/100)。

2.2膠體金免疫層析法碳青霉烯酶結(jié)果 100株CRKP中，產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的73株(73%)，產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶的10株(10%)，同時(shí)產(chǎn)KPC、NDM型碳青霉烯酶的12株(12%)，同時(shí)產(chǎn)IMP、NDM型碳青霉烯酶的1株(1%)，未檢出碳青霉烯酶的4株(4%)。見圖1、表1。

注：從左至右依次為產(chǎn)KPC、NDM、KPC+NDM、IMP+NDM型碳青霉烯酶。圖1 膠體金免疫層析法碳青霉烯酶檢測結(jié)果

表1 對(duì)CZA不同耐藥性的CRKP碳青霉烯酶檢測結(jié)果(n)

3 討 論

2020年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)結(jié)果顯示，KP對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2005年的3.0%和2.9%上升至2020年的23.2%和24.2%[12]。尤其是長期住院和住重癥監(jiān)護(hù)室的患者，CRKP的檢出已不再罕見。CRKP對(duì)常用抗菌藥物耐藥率高，常呈現(xiàn)泛耐藥，只有多黏菌素類和替加環(huán)素敏感性較好。但由于多黏菌素與較高的腎毒性風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而且靜脈使用可能對(duì)肺炎無效[9]。替加環(huán)素常規(guī)劑量使用時(shí)治療效果不理想，高劑量使用時(shí)，副作用也隨之增大，而且不適用于泌尿系感染[9]，導(dǎo)致臨床常面臨無藥可用的境地[13]。因此，急需一種新型有效的抗菌藥物來治療CRKP導(dǎo)致的感染。CRKP對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的機(jī)制有：產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失、主動(dòng)外排系統(tǒng)活躍等。其中最主要的機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，CRKP中常見的碳青霉烯酶有KPC、NDM、IMP、OXA、VIM等[14]。

CZA是美國食品和藥品監(jiān)督局第一個(gè)批準(zhǔn)的用于治療碳青霉烯耐藥腸桿菌目細(xì)菌所致感染的新型β-內(nèi)酰胺合劑。CZA是三代頭孢菌素頭孢他啶和新型酶的抑制劑阿維巴坦相結(jié)合，其中阿維巴坦比傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑具有更高的分子活性，可以抑制多種類型分解頭孢他啶的β-內(nèi)酰胺酶，而保護(hù)頭孢他啶的殺菌作用。阿維巴坦可以抑制的β-內(nèi)酰胺酶包括A類酶(如KPC-2等)、C類酶和某些D類酶(主要是OX-48等)，但對(duì)B類金屬酶無抑制作用，如NDM、IMP、VIM等[5,15]。阿維巴坦的作用機(jī)制與傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有所不同，主要區(qū)別在于傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑在與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)被破壞而失活；而阿維巴坦在與β-內(nèi)酰胺酶共價(jià)結(jié)合的過程中不會(huì)被水解，經(jīng)環(huán)合形成內(nèi)酰胺環(huán)后，阿維巴坦的活性又可以恢復(fù)[5]。而且阿維巴坦不會(huì)誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生[16]，這也是優(yōu)于傳統(tǒng)β-內(nèi)酰胺酶的重要特點(diǎn)。CZA可用于治療碳青霉烯耐藥腸桿菌目細(xì)菌所引起的醫(yī)院獲得性和呼吸機(jī)相關(guān)性細(xì)菌性肺炎、泌尿系感染、腹腔感染等疾病[5]，是治療產(chǎn)KPC和OXA-48型碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌的最佳選擇[16]。

本研究中CRKP對(duì)CZA的耐藥率為24%(24/100)，高于周琴等[17]報(bào)道的成都地區(qū)16.67%的耐藥率，與許曉波[18]的研究結(jié)果(24.8%)基本一致。本研究中對(duì)CZA耐藥的CRKP有24株，其中產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶的有10株，同時(shí)產(chǎn)KPC、NDM型碳青霉烯酶的有12株，同時(shí)產(chǎn)IMP、NDM型碳青霉烯酶的有1株，未檢出碳青霉烯酶的1株；對(duì)CZA敏感的CRKP有76株，其中產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的73株，未檢出碳青霉烯酶的3株。本研究中產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的CRKP對(duì)CZA的敏感率為100%(73/73)，而所有產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶的CRKP對(duì)CZA的耐藥率為100%(23/23)。因此，對(duì)于CRKP導(dǎo)致的感染，應(yīng)首先明確細(xì)菌所產(chǎn)碳青霉烯酶的類型。當(dāng)CRKP產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶時(shí)，其對(duì)CZA的敏感性較好，可以選擇用CZA來抗感染治療；而當(dāng)CRKP產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶時(shí)，通常對(duì)CZA耐藥，應(yīng)避免使用CZA進(jìn)行治療。此外，對(duì)于產(chǎn)金屬酶的CRKP選擇CZA和氨曲南進(jìn)行聯(lián)合用藥也有治療成功的報(bào)道[19-20]。

本研究中CRKP以產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶為主(占73%)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。4株CRKP未檢出碳青霉烯酶，可能的原因有：該碳青霉烯檢測試劑盒只能檢測KPC、NDM、 IMP、VIM、OXA等五種常見的碳青霉烯酶表型，若細(xì)菌含有SME、IMI等不常見的碳青霉烯酶表型則無法檢出；也可能是細(xì)菌存在除產(chǎn)生碳青霉烯酶以外的耐藥機(jī)制，如膜孔蛋白缺失或突變使膜的通透性下降或主動(dòng)外排系統(tǒng)活躍等。

綜上所述，本院CRKP以產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶為主，其次是同時(shí)產(chǎn)KPC、NDM型碳青霉烯酶及產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶。CRKP產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶時(shí)對(duì)CZA的敏感性較好，產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶時(shí)對(duì)CZA的敏感性較差。因此對(duì)于CRKP導(dǎo)致的感染，首先要明確細(xì)菌所產(chǎn)碳青霉烯酶的表型，才能更好地指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。