◎ 余 薇，鄧小華，劉 婷，潘篤杰，鄭巧雙

（湖北工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心，湖北 武漢 430019）

枯草芽孢桿菌是一種廣泛存在于自然界的好氧桿菌，該菌主要是通過消耗腸道內(nèi)多余的氧、降低氧化還原電位及環(huán)境pH，從而創(chuàng)造厭氧環(huán)境，抑制某些有害病菌，達(dá)到預(yù)防及治療某些腸道病的作用[1-2]。枯草芽孢桿菌還具有較強(qiáng)的多種酶促活性，能用于動(dòng)物飼料添加劑中發(fā)揮益生菌的功效[3]。水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中，在水體環(huán)境或者水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中使用枯草芽孢桿菌制劑能有效抑制甚至殺滅水體環(huán)境中的某些有害微生物，強(qiáng)化益生菌群體系，從而達(dá)到防治水產(chǎn)疾病的目的[4-5]。枯草芽孢桿菌在食品工業(yè)也有廣泛的應(yīng)用，例如日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)枯草桿菌能發(fā)酵納豆產(chǎn)生一種枯草桿菌蛋白激酶，這種酶能溶解血栓，可開發(fā)出一種新的溶栓藥品[6]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，枯草芽孢桿菌活菌劑還可以作為口服液治療腸炎、支氣管炎和腹瀉等多種疾病，也能用來預(yù)防和治療燒傷面感染等[7]。

目前枯草芽孢桿菌在飼料行業(yè)應(yīng)用廣泛，多采用固態(tài)發(fā)酵模式獲得高活菌數(shù)，菌粉純度不高，做法較為粗糙只能用于飼用行業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，而醫(yī)藥行業(yè)以及食品行業(yè)所需要的菌劑要求純度較高，有些也需要液態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物。因此，本研究對(duì)一株能改善腸道功能的藥食性益生型枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，期望解決現(xiàn)階段液態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)中存在的活菌數(shù)低、成本高等問題，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisHB82025），來源于湖北工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心。

營養(yǎng)肉湯NB：蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.1.2 儀器與設(shè)備

三角瓶、量筒、pH計(jì)、UV2600分光光度計(jì)（島津）、DL2002電子天平（梅特勒）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒）、BSC-1600ⅡA2生物安全柜（蘇凈安泰）、cx31三目顯微鏡（奧林巴斯）、生化培養(yǎng)箱（上海一恒）、自動(dòng)滅菌鍋（上海申安）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將保藏好的菌種凍存管（編號(hào)HB82025），按照5%接種量，接種于10 mL營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基中， 37 ℃，200 r·min-1，活化16 h，然后將活化種按照5%接種量接種于50 mL NB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1，培養(yǎng)8 h，作為一級(jí)種子液，按照5%接種量接種于發(fā)酵液，采用三角瓶裝發(fā)酵液，裝液量為1/10（v/v），于37 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，進(jìn)行培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.2 碳源篩選

在原始NB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和淀粉作為額外碳源，添加量均為0.5%，并設(shè)置空白，于37 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后采用傾注法[8]活菌計(jì)數(shù)，檢測發(fā)酵液中的活菌含量以篩選最佳碳源。

1.2.3 氮源篩選

在上述1.2.2確定的最佳碳源基礎(chǔ)上，分別以蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉粉、酵母粉和尿素作為氮源，添加量均為2%，于37 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h檢測發(fā)酵液中的活菌含量以篩選最佳氮源。

1.2.4 無機(jī)鹽篩選

無機(jī)鹽選擇1#—氯化鈉、2#—MgSO4.7H2O、3#—MnSO4.H2O、4#—磷 酸 二 氫 鉀（0.25%）+磷酸 氫 二 鉀（0.25%）及5#—MgSO4·7H2O（0.07%）+MnSO4·H2O（0.03%）+磷酸二氫鉀（0.2%）+磷酸氫二鉀（0.2%）；無機(jī)鹽總量控制在0.5%，于37 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)以篩選最佳的無機(jī)鹽。

1.2.5 菌株生長曲線測定

將保藏凍存管活化好后，種子液及發(fā)酵液均采用上述篩選出的最佳培養(yǎng)基，種子液活化及接種量、發(fā)酵參數(shù)等均同1.2.1，自接種后每2 h取樣1次測定菌液的OD600，用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.2.6 發(fā)酵模式優(yōu)化

將24 h連續(xù)搖床發(fā)酵改為分段式補(bǔ)料發(fā)酵模式，發(fā)酵液接種后在第一階段發(fā)酵14 h，然后將發(fā)酵培養(yǎng)基按照1∶1補(bǔ)料，再連續(xù)發(fā)酵10 h，結(jié)束發(fā)酵；取樣測定發(fā)酵液活菌等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機(jī)鹽優(yōu)化結(jié)果分別如圖1～ 圖3所示。

圖1 碳源對(duì)菌株生長影響圖

圖2 氮源對(duì)菌株生長影響圖

圖3 無機(jī)鹽對(duì)菌株生長影響圖

（1）碳源篩選。在原始營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，額外添加0.5%葡萄糖、蔗糖等作為碳源，除了淀粉外，其他實(shí)驗(yàn)組均有明顯的促生長作用，葡萄糖作為單糖也明顯優(yōu)于蔗糖和麥芽糖。

（2）氮源篩選。將大豆蛋白胨作為氮源替代普通蛋白胨，對(duì)該枯草芽孢桿菌有很明顯的促生長作用，尿素作為氮源效果最差，而蛋白胨、牛肉粉、酵母粉效果相當(dāng)。

（3）無機(jī)鹽篩選。采用5組無機(jī)鹽添加配比，篩選最佳的無機(jī)鹽組分，由圖3可以看到2#、4#分別采用MgSO4·7H2O以及磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀替代NaCl，對(duì)枯草芽孢桿菌的生長有一定促進(jìn)作用，但是不顯著；3#效果更差一些，可能是Mn+濃度過高，對(duì)菌株生長產(chǎn)生了抑制；5#采用MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀4種無機(jī)鹽進(jìn)行復(fù)配，其促生長效果很顯著。

2.2 發(fā)酵模式改進(jìn)優(yōu)化

該菌種采用上述最優(yōu)培養(yǎng)基發(fā)酵，生長曲線如圖4 所示。由圖4可知，0～4 h為菌株生長的停滯期，菌數(shù)增長很少，而4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，14 h到達(dá)生長高峰，10～14 h為生長穩(wěn)定期，菌株生長緩慢， 14 h后生物量開始減少，進(jìn)入衰亡期。以該生長曲線作為參考，在其到達(dá)最高點(diǎn)時(shí)調(diào)整發(fā)酵模式，在14 h后進(jìn)行補(bǔ)料，添加新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)發(fā)酵10 h，延長其對(duì)數(shù)生長期。

圖4 菌株生長曲線圖

改進(jìn)發(fā)酵模式后，相應(yīng)發(fā)酵液活菌如表1所示。

表1 不同發(fā)酵模式生物量表

由表1可知，更改發(fā)酵模式采用分段發(fā)酵，發(fā)酵14 h后補(bǔ)料，新加入培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵10 h，因新增營養(yǎng)，有利于發(fā)酵過程中菌體生長期延長，能有效提高其發(fā)酵液活菌生物量情況。OD600提高近1倍，而活菌也由2.48×109CFU·mL-1提高到8.4×109CFU·mL-1，優(yōu)化效果非常顯著，該發(fā)酵模式對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵放大具有很大的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)一株藥食性益生型枯草芽孢桿菌的液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為0.5%葡萄糖、2%大豆蛋白胨、0.07% MgSO4·7H2O、0.03% MnSO4·H2O、0.2%磷酸二氫鉀、0.2%磷酸氫二鉀，pH=7.2，接種量5%，裝液量10%，搖床轉(zhuǎn)速 200 r·min-1、發(fā)酵14 h后按照1∶1補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵10 h，整個(gè)發(fā)酵時(shí)間為24 h。該液態(tài)發(fā)酵條件下，發(fā)酵液活菌高達(dá)8.4×109CFU·mL-1，優(yōu)化效果顯著。