翟妞，徐國(guó)云，張慧，鄭慶霞，陳千思，劉萍萍，王晨，金立鋒，周會(huì)娜

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

植物原生質(zhì)體是去除細(xì)胞壁后被質(zhì)膜包被的活性細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工程和分子生物學(xué)研究，如作物改良［1］、突變體創(chuàng)制［2］、基因亞細(xì)胞定位［3］和基因沉默與基因編輯［4-5］等。近年來(lái)，隨著植物單細(xì)胞組學(xué)的快速發(fā)展，植物原生質(zhì)體尤其是擬南芥根原生質(zhì)體作為組織特異的材料［6-7］被廣泛應(yīng)用于植物單細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及代謝組學(xué)的研究中［8-9］，為植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗脅迫研究提供了新思路。高活性的原生質(zhì)體是細(xì)胞水平組學(xué)分析的基礎(chǔ)，因此植物原生質(zhì)體制備技術(shù)愈來(lái)愈被重視?，F(xiàn)有植物組織原生質(zhì)體制備方法主要有機(jī)械法、化學(xué)法和酶解法，其中酶解法是最有效快速分離原生質(zhì)體的方法［10］。煙草作為主要的模式植物之一，對(duì)植物學(xué)的研究具有重要意義。目前有關(guān)煙草組織原生質(zhì)體的制備方法，常見(jiàn)的主要是葉肉細(xì)胞的分離［11-12］，而煙草根尖原生質(zhì)體的制備則鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。根是煙草吸收營(yíng)養(yǎng)元素的關(guān)鍵部位，也是生物堿的合成場(chǎng)所，建立有效的煙草根原生質(zhì)體的制備方法，對(duì)在細(xì)胞水平上研究煙草營(yíng)養(yǎng)和生物堿代謝具有重要意義。為此，以本氏煙草和栽培煙草K326為材料，利用酶解法制備了煙草根原生質(zhì)體，并通過(guò)優(yōu)化酶解液組合、酶解時(shí)間和酶解滲透壓等條件，獲得了較高活性和數(shù)量的根原生質(zhì)體，旨在為煙草基因功能的驗(yàn)證以及單細(xì)胞組學(xué)的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 煙草根材料

培養(yǎng)皿點(diǎn)種的煙草（本氏煙草和栽培煙草K326）根，光照培養(yǎng)箱中培育，每天12 h光照（28℃）、12 h黑暗（25℃）處理；7 d時(shí)，采集離根尖0.5 cm的根，去離子水沖洗3次，置于冰上預(yù)冷的培養(yǎng)皿中備用。

1.1.2 試劑

纖維素酶R-10、果膠酶Y-23和離析酶R-10（日本Yakult公司）；甘露醇（美國(guó)Amresco公司）；甘油和0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液［生工生物工程（上海）股份有限公司］；牛血清白蛋白BSA（美國(guó)Sigma公司）；其他常規(guī)試劑均為中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司試劑。原生質(zhì)體裂解緩沖液為實(shí)驗(yàn)室自配（0.3～0.5 mol/L甘露醇，10 mmol/L KCl，10 mmol/L CaCl2和0.1%BSA）。

1.1.3 儀器

電子天平（PL-602L，瑞士Mettler Toledo公司）、超純水一體化系統(tǒng)（PURELAB Pulse，英國(guó)ELGA公司）、冷凍臺(tái)式離心機(jī)（FRESCO 21，美國(guó)Thermo公司）、植物光照培養(yǎng)箱（E-36L2，美國(guó)Percival公司）、恒溫?fù)u床（770R，美國(guó)APLUS公司）、pH計(jì)（S210-K，瑞士Mettler Toledo公司）、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（TC20，美國(guó)Bio-Rad公司）、倒置顯微鏡（DWI400，德國(guó)Leica公司）。

離心管（美國(guó)Thermo公司）；10 cm植物培養(yǎng)皿［生工生物工程（上海）股份有限公司］；手術(shù)刀片［生工生物工程（上海）股份有限公司］；移液管（美國(guó)Thermo公司）；40μm細(xì)胞篩（美國(guó)Corning公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 根尖細(xì)胞的酶解法分離

參考Zhang等［13］的方法制備根尖細(xì)胞，并作優(yōu)化處理。具體方法：將生長(zhǎng)7 d左右的煙草根用無(wú)菌水清洗3次，濾紙吸干，沿根尖方向刀片切取0.5 cm。將處理后的根置于50 mL離心管中加入配制好的酶解液10 mL，以50 r/min、28℃條件下避光振蕩處理1～5 h。裂解結(jié)束后，將酶解液過(guò)直徑40μm細(xì)胞篩，收集濾液。以500 r/min離心10 min，去除上清液。以8%Mannitol懸浮，500 r/min離心5 min，重復(fù)3～4次。緩沖液重新懸浮，即為根尖細(xì)胞原生質(zhì)體。

1.2.2 原生質(zhì)體數(shù)量與活性分析

參考Kang等［14］的方法進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)及活性檢測(cè)，并作適當(dāng)調(diào)整。具體操作：取原生質(zhì)體懸液20μL，加20μL臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻，靜置10 s。將10μL原生質(zhì)體懸液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，靜置30 s，插入細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，讀取細(xì)胞密度D（個(gè)/mL）并計(jì)算成活率。每個(gè)樣本設(shè)置3次重復(fù)。計(jì)算公式：

1.2.3 熒光顯微鏡觀(guān)察原生質(zhì)體

參考聶瓊等［12］的方法于顯微鏡下觀(guān)察原生質(zhì)體。具體操作：直接吸取酶解過(guò)程中的根尖細(xì)胞原生質(zhì)體懸浮液，于6孔板中在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。設(shè)置不同時(shí)間，每隔1 h倒置顯微鏡觀(guān)察1次。觀(guān)察時(shí)先在低倍鏡下找到原生質(zhì)體后更換高倍鏡觀(guān)察，上下調(diào)動(dòng)細(xì)螺旋，以便看到清晰透亮原生質(zhì)體細(xì)胞，并同時(shí)拍照記錄原生質(zhì)體的實(shí)時(shí)狀態(tài)。根尖細(xì)胞裂解結(jié)束后，吸取10μL原生質(zhì)體懸液，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，倒置顯微鏡觀(guān)察原生質(zhì)體狀態(tài)，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶組分對(duì)根尖原生質(zhì)體分離的影響

依據(jù)其他植物（擬南芥、水稻等）根原生質(zhì)體的制備方法［13，15-16］，對(duì)不同的裂解酶組合裂解本氏煙草根尖進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)相同時(shí)間，與離析酶+纖維素酶的組合相比，果膠酶+纖維素酶的組合裂解煙草根尖更容易獲得原生質(zhì)體（圖1A），且效率更高；而對(duì)于酶濃度的考察，相對(duì)于1.0%果膠酶和1.0%纖維素酶組合，1.5%果膠酶和1.5%纖維素酶組合能獲得更多的原生質(zhì)體（圖1B）。因此，對(duì)于煙草根尖原生質(zhì)體的制備，1.5%果膠酶和1.5%纖維素酶組合更有效。

圖1 不同裂解酶組分下的原生質(zhì)體狀態(tài)Fig.1 Morphology of protoplasts with different lyase combinations

2.2 滲透壓對(duì)根尖原生質(zhì)體分離的影響

利用1.5%果膠酶和1.5%纖維素酶組合，通過(guò)不同濃度的甘露醇（0.2～0.5 mol/L）調(diào)節(jié)裂解液的滲透壓，酶解本氏煙草根尖3 h，并對(duì)獲得的根尖原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著甘露醇濃度的增加，根尖原生質(zhì)體數(shù)量先增加后減少，尤其是甘露醇達(dá)0.5 mol/L時(shí)，根原生質(zhì)體數(shù)量急劇降低（圖2A）；但是隨著甘露醇濃度的增加，尤其是甘露醇濃度由0.3 mol/L到0.4 mol/L時(shí)，原生質(zhì)體的活性由25%急速增加到63%，而甘露醇達(dá)0.5 mol/L時(shí)卻略有降低。因此煙草根尖原生質(zhì)體裂解時(shí)，甘露醇適宜濃度為0.4 mol/L。

圖2 不同滲透壓下的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性比較Fig.2 Yields and vitalities of protoplasts under different osmotic pressures

2.3 酶解時(shí)間對(duì)根尖原生質(zhì)體分離的影響

利用優(yōu)化的裂解酶和甘露醇組合，酶解本氏煙草根尖1～3 h，顯微鏡觀(guān)察結(jié)果如圖3所示：隨著酶解時(shí)間的增加，1 h時(shí)煙草根尖細(xì)胞原生質(zhì)體成團(tuán)聚集、2 h時(shí)逐漸分離、3 h時(shí)形成單細(xì)胞懸液，且2 h和3 h時(shí)原生質(zhì)體狀態(tài)飽滿(mǎn)。因此，煙草根尖細(xì)胞原生質(zhì)體的較適宜解離時(shí)間為2～3 h。

圖3 不同酶解時(shí)間的原生質(zhì)體狀態(tài)Fig.3 Morphology of protoplasts under different enzymatic hydrolysis durations

同時(shí)對(duì)不同裂解時(shí)間獲得的根原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)和活性檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸增加（圖4A）；而原生質(zhì)體的活性，隨著酶解時(shí)間的增加，成活率先增加后降低，2 h時(shí)的活性最高，達(dá)到70%?？梢?jiàn)，依據(jù)根尖原生質(zhì)體的產(chǎn)量和成活率，合適的酶解時(shí)間為2 h。

圖4 不同酶解時(shí)間的原生質(zhì)體產(chǎn)量（A）和活性（B）Fig.4 Yields（A）and vitalities（B）of protoplasts under different enzymatic hydrolysis durations

2.4 不同煙草品種對(duì)根尖原生質(zhì)體分離的影響

利用優(yōu)化的方法分別裂解K326和本氏煙草的根尖，對(duì)獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，同時(shí)進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同樣裂解條件下，本氏煙草根尖原生質(zhì)體的活性較高、碎片較少（圖5A），K326根原生質(zhì)體的活性較低、碎片較多（圖5B）。而同樣裂解條件下，獲得的K326和本氏煙草的根尖原生質(zhì)體數(shù)量相當(dāng)，均達(dá)到105數(shù)量級(jí)。

圖5 不同煙草品種根尖原生質(zhì)體的活性檢測(cè)Fig.5 Vitalities of root tip protoplasts of different tobacco varieties

3 討論

影響植物組織原生質(zhì)體分離制備的因素很多，其中裂解酶的組合與濃度、裂解液滲透壓和裂解時(shí)間等因素的影響最大［17-18］。因此對(duì)于煙草根尖原生質(zhì)體的制備，重點(diǎn)考察這三方面的因素。通常煙草原生質(zhì)體主要指煙草葉肉原生質(zhì)體，煙草根尖原生質(zhì)體涉及很少，主要原因是煙草根原生質(zhì)體制備困難。

與煙草葉肉原生質(zhì)體制備比，根尖原生質(zhì)體制備的難點(diǎn)：①盡管煙草葉肉和根原生質(zhì)體制備都首選酶解法，但是裂解酶的組合不同（葉肉常用纖維素酶+離析酶，根選用纖維素酶+果膠酶），并且根原生質(zhì)體制備裂解酶的濃度遠(yuǎn)高于葉肉［6，11］。主要源于煙草根的纖維化程度高，纖維素含量高。②煙草根原生質(zhì)體制備取材受限較大。根原生質(zhì)體的制備只能采用組培或者水培幾天的根尖（此時(shí)根尖纖維化程度相對(duì)較低），能夠獲得原生質(zhì)體的數(shù)量也少；而葉肉原生質(zhì)體制備可以選取大田、溫室、水培、組培等苗期煙葉，能夠獲得的葉肉原生質(zhì)體數(shù)量幾乎沒(méi)有限制［19］。

由于煙草根尖分化程度低且細(xì)胞質(zhì)體含量極低，因此煙草根原生質(zhì)體是細(xì)胞誘導(dǎo)分化、單細(xì)胞組學(xué)等研究的極佳材料。本研究中通過(guò)優(yōu)化裂解酶組合及作用濃度、裂解滲透壓及裂解時(shí)間，能夠獲得活性大于70%、數(shù)量達(dá)到105數(shù)量級(jí)的煙草根原生質(zhì)體。與其他物種相比，煙草根原生質(zhì)體的活性相對(duì)較低，為此，應(yīng)進(jìn)一步調(diào)整優(yōu)化裂解酶組合和裂解時(shí)間，以獲得活性大于90%的根原生質(zhì)體，滿(mǎn)足煙草細(xì)胞組學(xué)研究更深層次的需求。

4 結(jié)論

煙草根原生質(zhì)體制備的適宜條件：材料為培養(yǎng)皿中點(diǎn)種7 d的無(wú)菌根尖；酶解液組合為1.5%纖維素酶＋1.5%果膠酶；裂解液甘露醇濃度為0.4 mol/L；裂解時(shí)間為2 h。利用優(yōu)化后的分離方法，可以獲得活性大于70%、數(shù)量達(dá)到105數(shù)量級(jí)的較高質(zhì)量的煙草根原生質(zhì)體。